Cloning and expression of frutapin in Escherichia coli: structural analysis

Plant lectins are proteins which are able to promote specific recognition and reversible binding to selective sugars in carbohydrates or glycoconjugates without altering their covalent structure. Due to these inherent features, lectins can interact with cell surface moieties and display both inflammatory and anti-inflammatory, as well as immunomodulatory and immunostimulatory, properties. Artocarpus incisa is a widespread plant, common in pan-tropical regions, and popularly known as “fruta-pão” (breadfruit) in Brazil, where it is consumed cooked by local populations. Frutapin (FTP) is the second most abundant lectin in A. incisa seeds, belonging to the mannose-binding subfamily of jacalin-related lectins (JRL). FTP proved difficult to purify with very low yields and contamination with Frutalin (a multiple-binding lectin and most abundant in the same species), which have frustrated its characterization so far. In this work, we developed a high-level expression system of biologically active recombinant FTP in Escherichia coli BL21 using a SUMO-tag strategy, optimizing conditions with the best set yielding >40 mg/l culture of soluble active rFTP. Apo-FTP, FTP–mannose and FTP–glucose crystals were obtained, and they diffracted X-rays to a resolution of 1.58 (P212121), 1.70 (P3121) and 1.60 (P3121) Å, respectively. The best solution showed four monomers per asymmetric unit. Molecular dynamics (MD) simulation suggested that FTP displays higher affinity for mannose than glucose. The ability of rFTP to interact with TLR4 was evaluated using HEK-Blue™-hTLR4 cells. Also, the effect of FTP on fibroblast biology was assessed through cell migration assay, IL-6 production and western blot analysis. rFTP did not show cytotoxicity to human skin fibroblasts (<1,000 µg/mL). After 8 h, samples treated with FTP had significant numbers of migrated cells when compared to controls, migrating across the denuded area and effecting efficient wound closure. rFTP was able to potently stimulate the TLR4 pathway in a manner similar to that observed with LPS. High levels of IL6 production were observed when compared to untreated cells (p<0.0001). The levels of pERK 1/2 and MyD88 were significantly higher when compared to untreated cells after 24 h (p<0.05). In conclusion, this study showed that rFTP was non-cytotoxic to human fibroblasts. Given that fibroblasts play an important role in tissue repair, rFTP may represent a potential therapeutic biomolecule for wound healing and other related skin diseases.As lectinas vegetais são proteínas capazes de reconhecimento específico e ligação reversível a carboidratos ou glicoconjugados, sem alterar a estrutura covalente dos mesmos. Devido a estas características inerentes, elas podem interagir com a superfície celular e exibir tanto propriedades inflamatórias e anti-inflamatórias, além de imunomoduladoras e imunoestimulantes. Artocarpus incisa é uma espécie comum em regiões pantropicais, conhecida popularmente no Brasil como fruta-pão, onde é consumida cozida pela população. A frutapina (FTP) é a segunda lectina mais abundante em sementes de A. incisa, pertencente à subfamília de lectinas manose ligantes da família das jacalin-like. Em estudos preliminares, FTP foi de difícil purificação, com rendimentos muito baixos e contaminação com frutalina (a lectina mais abundante e de caráter multivalente nas sementes da mesma espécie). Neste trabalho, foi desenvolvido um sistema de expressão heteróloga da rFTP em Escherichia coli (BL21DE) usando a estratégia SUMO-tag, com rendimento médio superior a 40 mg de proteína solúvel por litro de cultura. Cristais da Apo-FTP, FTP-manose e FTP-glucose foram obtidos e submetidos à difração de raio-x , apresentando resolução de 1,58 (P212121), 1,70 (P3121) e 1,60 (P3121) Å, respectivamente. A melhor solução mostrou quatro monômeros por unidade assimétrica. Simulações com dinâmica molecular demonstraram que FTP exibe maior afinidade por manose do que glucose. A capacidade da rFTP em interagir com o receptor TLR4 foi avaliada (HEK-Blue™-hTLR4). Além disso, o efeito da FTP na fisiologia de fibroblastos, de pele humana, foi avaliado por meio de ensaios de migração celular, produção de IL-6 e Western blot. A rFTP não mostrou citotoxicidade para os fibroblastos (<1 000 μg / mL). A partir de 8 h de tratamento, amostras tratadas com FTP tiveram um número significativo de células migradas quando comparadas ao controle. A rFTP estimulou o TLR4 de maneira similar àquela observada com o LPS. Concentrações elevadas de IL6 foram observadas em fibroblastos tratados. Os níveis de pERK 1/2 e MyD88 foram significativamente maiores quando comparados com os dos controle, durante 24 h de tratamento (p< 0,05). Assim, este estudo mostrou que rFTP não foi citotóxica para fibroblastos humanos. Sabendo que fibroblastos desempenham um importante papel no reparo de tecidos, rFTP representa uma biomolécula com potencial terapêutico para a cicatrização de feridas e outras doenças de pele