Cloning and characterization of fructosyltransferase enzymes of halophilic archaea

Fruktanlar fruktoziltransferaz enzimleri tarafından üretilen ve suda çözünen homopolimerlerdir. Fruktanlar benzersiz fizikokimyasal özellikleri ve çeşitli fonksiyonlarıyla gelecek vaad eden polimerlerdir. İnsan sağlığına olumlu etkileri bulunur. Kimya, kozmetik, gıda ve ilaç endüstrilerinde çeşitli uygulamaları bulunmaktadır. Fruktanlar bakteriler, bitkiler, mantarlar, algler ve bazı halofilik arkelerde bulunurlar. Halomicrobium IBSBa bu halofilik arkelerden biridir. Bu çalışmada Halomicrobium IBSBa’da bulunan GH68 ailesi geni klonlanarak fruktoziltransferaz enzimi saflaştırılmıştır. Arkel fruktoziltransferaz enziminin çeşidinin bulunması ve bu enzimin ve ürettiği fruktanın yüksek tuzlu habitatlarda fonksiyonel öneminin anlaşılması amaçlanmıştır. Bu tez çalışması kapsamında Halomicrobium IBSBa'dan alınan GH68 ailesi geni, 6xHis Tag ile pET-28a (+) vektörünün C terminaline klonlanmıştır ve Escherichia coli'de eksprese edilmiştir. Saflaştırılmış rekombinant enzim HmcIsc'nin tahmin edilen protein moleküler ağırlığı 49.01 kDa’dur. Rekombinant enzim HmcIsc 'den üretilen ürün, Nükleer Manyetik Rezonans (NMR) ile inülin olarak tanımlanmıştır. Bu nedenle HmcIsc, inülosukraz (EC 2.4.1.9) olarak kabul edilmiştir. Bu çalışmada, halofilik arkel inülosukraz literatürde bir ilk olarak karakterize edilmiştir. HmcIsc enziminin optimum şekilde çalışması için 3.5 M NaCl gereklidir. pH ve sıcaklık optimumları sırasıyla 7 ve 45˚C'dir. Ayrıca 5 mM EDTA ilavesi, enzim aktivitesini 17% artırmaktadır. Öte yandan, HmcIsc bazı iki değerlikli katyonlar ve deterjanlar tarafından inhibe edilmiştir. HmcIsc enzimi Michaelis-Menten kinetiğine uymaktadır. Maksimum spesifik aktivite ile Michaelis-Menten sabiti sırasıyla 3.13±0.061 U/mg protein ve 37.51±3.367 mM sukrazdır. HmcIsc enzimi, inulosukrazın bilinmeyen mekanizmasını aydınlatmak ve çok yüksek tuzlu ortamlardaki bilinmeyen dinamiği keşfetmek amacıyla gelecekteki araştırmalar için önemlidir. Ayrıca, dünyanın karşı karşıya kaldığı tuzlanma tehdidine karşı HmcIsc enzimi çözümün bir parçası olma potansiyeline sahiptir.--------------------Fructans are water-soluble homopolymers produced by fructosyltransferases. Fructans are promising polymers with unique physicochemical properties and various functionalities. They have beneficial effects on human health, and they have various applications in cosmetics, food, pharmaceutical and chemical industries. Fructans are found in bacteria, plants, fungi, algae, and some halophilic archaea. One of these halophilic archaea is Halomicrobium IBSBa. In this study, GH68 family gene from Halomicrobium IBSBa was cloned and archaeal fructosyltransferase enzyme was purified. The aim was to find which type of enzyme it is and its product. It was aimed to understand their functional importance in hypersaline environments. Within the scope of this thesis, GH68 family gene of Halomicrobium IBSBa was cloned into pET-28a(+) vector with a 6xHis Tag at its C-terminus and expressed in Escherichia coli. Predicted protein molecular weight of the purified recombinant enzyme HmcIsc was 49.01 kDa. Product of recombinant enzyme HmcIsc was identified as inulin by Nuclear Magnetic Resonance (NMR). Thus, HmcIsc was recognized as inulosucrase (EC 2.4.1.9). In this study, halophilic archaeal inulosucrase was firstly characterized in literature. HmcIsc enzyme works optimally with 3.5 M NaCl. pH and temperature optima are 7 and 45˚C, respectively. Also, addition of 5 mM EDTA increases the enzyme activity by 17%. On the other hand, HmcIsc was inhibited by some divalent cations and detergents. HmcIsc enzyme shows Michaelis-Menten kinetics behavior with 3.13±0.061 U/mg protein as maximum specific activity (Vmax) and 37.51±3.367 mM sucrose as Michaelis-Menten (KM) constant. HmcIsc is important enzyme for future research to enlighten the unknown mechanism of inulosucrase and discover the unknown dynamic in hypersaline environments. In addition, HmcIsc might have potential to counteract to threat of salinization problem the world faces