Isolation and characterization of haloarqueas grown in aromatics and construction of molecular tools to study the protein secretion in the Domain Archaea

Orientador: Lucia Regina DurrantTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de AlimentosResumo: O metabolismo de compostos aromáticos depende de fatores físico-químicos como temperatura, pH e salinidade, e é bem conhecido e caracterizado em microrganismos mesófilos e em condições ambientais moderadas. No entanto, pouco se conhece sobre o metabolismo desses compostos em ambientes hipersalinos. este trabalho, cinco ambientes hipersalinos foram analisados quanto à presença de arqueas halofílicas capazes de metabolizar compostos aromáticos: Salar de Uyuni (Bolívia), salinas de Cahuil (Chile), salinas de Cabo Rojo (Porto Rico), sabkhas da região do Golfo Pérsico (Arábia Saudita) e Mar Morto (Israel e Jordânia). A estratégia empregada para o enriquecimento e isolamento de arqueas halofílicas capazes de crescer em presença de compostos aromáticos foi bem sucedida. Foram isoladas 12 linhagens capazes de crescer em presença de 1 ,2--benzoantraceno (2 mM) e 44 linhagens capazes de crescer em presença de ácido p-hidroxibenzóico (10 mM) como única fonte de carbono e energia. O isolado MM 17, proveniente de uma amostra de água do Mar Morto, apresentou o melhor resultado de crescimento e foi capaz de degradar completamente os ácidos benzóico (10 mM) e p-hidroxibenzóico (10 mM) após 200 h de cultivo. As análises bioquímica e genética dos isolados, juntamente com a análise dos perfis de lipídeos polares, indicaram que as linhagens estudadas pertencem a pelo menos dois gêneros: Haloferax e Halobacterium. Foi determinada a secreção de uma proteína de alto peso molecular por Haloferax volcanii em resposta à presença de 2 mM 1 ,2-benzoantraceno no meio de cultivo. Com o objetivo de estudar o mecanismo de secreção protéica em haloarqueas, o qual não é completamente entendido_ foram realizadas a clonagem molecular dos genes secD e secY de Haloferax volcanii, a expressão heteróloga em Escherichia coli e a purificação dos produtos gênicos, além de uma tentativa preliminar de obtenção de anticorpos policlonais através da imunização de coelhosAbstract: The metabolism of aromatic compounds depends on physical-chemical factors such as temperature, pH and salinity, and is well known and characterized in mesophilic microorganisms under mild environmental conditions. Little is known, however, about the metabolism of these compounds in highly saline environments. Here, five hypersaline sites were tested for the presence of halophilic archaea able to metabolize aromatic compounds: the Uyuni Salt Marsh (Bolivia), the crystallizer ponds in Cahuil (Chile), the crystallizer ponds in Cabo Rojo (Puerto Rico), the sabkhas in the Persian Gulf (Saudi Arabia) and the Dead Sea (Israel and Jordan). The strategy used for the enrichment and isolation of halophilic archaea able to grow in aromatic compounds was successful. Twelve strains able to grow in 1,2-benzoantracene (2 mM) and 44 strains able to grow in p-hydroxybenzoic acid (10 mM) as the sole carbon and energy source were isolated. Strain MM17, isolated from a Dead Sea water sample, showed the best growth and was able to degrade benzoic (10 mM) and p-hydroxybenzoic (10 mM) acids afier 200 h of cultivation. Biochemical and genetic analyses of the isolates, together with the analysis of polar lipid profiles, indicate that the strains belong to at least two different genera: Haloferax and Halobacterium. The secretion of a high molecular weight protein by Haloferax volcanii following cultivation in 2 mM 1,2-benzoantracene was observed. To study the mechanism of protein secretion in halophilic archaea, a process that is not completely understood, preliminary studies were conducted, which included cloning of secO and secY genes of Haloferax volcanii, their heterologous expression in Escherichia coli and the purification of the gene products. In addition, a preliminary attempt to obtain polyclonal antibodies through rabbit immunization was madeDoutoradoDoutor em Ciência de Alimento