Purification and Characterization of Levansucrase by Halomonas smyrnensis AAD6T

ÖZETHalomonas smyrnensis AAD6T’den İzole edİlen levansukraz enzİmİnİn saflaştırılması ve karakterİzasyonuEkstremofiller tarafından üretilen mikrobiyal polimerler, gösterdikleri farklı fizikokimyasal ve reolojik özellikleri ile büyük önem taşırlar. Buna ek olarak, bu polimerler biyobozunurluk ve biyouyumluluk özellikleri sayesinde gıda, ziraat, kozmetik, farmasötik endüstrisi gibi farklı endüstrilerde kullanım potansiyeli göstermektedirler. Antitümör, antiülser, kolestrol düşürücü olma ve immune sistemi düzenleme gibi önem arzeden özellikleri nedeniyle, son yıllarda, özellikle farmasötik endüstrisinde, polisakkaritler gittikçe önem kazanmaktadır. Bir fruktoz polimeri olan levanın sentezinden sorumlu olan enzim grubu fruktosiltransferazlar veya levansukraz olarak anılır. Levansukraz (EC 2.4.1.10), sükrozu fruktoz ve glukoza parçalar, sonrasında fruktoz moleküllerini polimerize ederek biyopolimer oluşturur. Levansukraz enzimi, Pseudomonas, Zymomonas, Bacillus, ve Corynebacterium gibi farklı mikroorganizmalardan izole edilmesine ragmen, bu tezde, Halomonas smyrnensis AAD6 T suşu, levansukraz üreten ilk halofilik olarak tanımlanmıştır. Bu çalışmada, levansukraz üretim ve saflaştırılmasının levan polimer üretimi ile eş zamanlı olarak yapılmasını amaçlayan hızlı bir prosedür oluşturulmuş ve uygulanmıştır. Saflaştırma aşamasındaki adımlarda optimizasyon çalışmaları yapılarak prosedürün hem polimer hem de enzim üretimine olanak sağlaması için çalışılmıştır. Sukroz dışında karbon kaynağı olarak glukoz denenmiş polimer üretimi olmadığı için enziminde üretilmediği, levansukraz üretiminin sukroz ile indüklendiği gösterilmiştir. Kromatografi sonrası en yüksek aktivite gösteren fraksiyonda farklı sıcaklık, pH ve tuz konsantrasyonları denenmiştir. Optimum sıcaklık, pH ve tuz konsantrasyonu sırasıyla 37 0C, pH 7 ve 2M NaCl olarak belirlenmiştir. Konvansiyonel protein saflaştırma yöntemlerinin bu biyopolimer için uygulanamadığı gösterilmiş; öngörülen yöntemle elde edilen protein miktarı çok düşük olduğu için H. smyrnensis AAD6T levansukraz enzimine ait gen bölgesi pET101D-TOPO vektörüne aktarılmış ve pilot protein ekspresyon denemeleri yapılmıştır. Rekombinant enzim üretimi için gerekli ön çalışmalar tamamlanmıştır.ABSTRACTPurification and Characterization of Levansucrase by Halomonas smyrnensis AAD6TMicrobial polymers produced by extremophiles have great importance since they have distinct physicochemical and rheological properties. Furthermore, these polymers are biodegradable and biocompatible and these properties make them good candidates to be used in different industries such as food, agricultural, cosmetic, pharmaceutical and chemical. In recent years, especially in pharmaceutical industry, polysaccharides are special interest because they may contribute to human health due to their antitumor, antiulcer, immunomodulating, or cholesterol-lowering activities. Enzymes responsible for the synthesis of fructose homopolymer named levan biopolymer are generally referred to as fructosyltransferases (FTF) or levansucrases (sucrose: 2,6-â-D-fructan 6-â-D-fructosyltransferase, EC 2.4.1.10). Levansucrase (EC 2.4.1.10) as a biocatalyst in levan synthesis splits sucrose into fructose and glucose, and polymerizes the fructose molecules to biopolymer chain. Although levansucrases are produced by various microorganisms including strains of Pseudomonas, Zymomonas, Bacillus, and Corynebacterium species, in this thesis, halophilic Halomonas smyrnensis AAD6 T strain was reported as the first halophilic producer of levansucrase. In the present study, we designed a downstream processing strategy to recover the enzyme from the fermentation broth and also levan polymer, simultaneously. By changing the salinity conditions, a very fast protocol was developed and applied. Optimization of the steps in the purification process was performed to obtain both enzyme and polymer. Glucose was used as a carbon source, however results have shown that levansucrase is induced by sucrose. After chromatography, the fraction with high enzymatic activity was examined and optimum temperature, pH and salt concentration were determined as 370C, pH7 and 2M NaCl respectively. Since purification conventional methods were not efficient and suggested procedure was concluded with low protein concentrations, levansucrase gene region from H. smyrnensiswas transferred into pET101D-TOPO vector as well as pilot expression of the recombinant levansucrase was performed