Extração de DNA de Catasetum gladiatorium K. G. Lacerda (Orchidaceae) para uso em estudos moleculares

Catasetum gladiatorium is endemic to Brazil, being usually found in areas subjected to environmental disturbances that may affect its genetic diversity. Analyses of genetic diversity require extraction of pure DNA through fast and efficient protocols. We propose here an efficient protocol to extract the DNA of C. gladiatorium for use in molecular analyses. DNA was extracted from leaf tissue using eight protocols based on the CTAB method. We tested: (1) two types of plant material maceration (using STE buffer and liquid nitrogen); (2) two CTAB concentrations (2% and 5%); and (3) two concentrations of β-mercaptoethanol (0% and 2%) in the extraction buffer. We performed amplification reactions with the extracted DNA using two ISSR primers. The methods of plant material maceration influenced the quality and amount of DNA extracted from C. gladiatorium. Maceration with liquid nitrogen allowed us to obtain high-quality DNA in all other variations of the tested protocols. On the other hand, maceration with STE yielded DNA at low concentrations and highly degraded. The best results were obtained using 5% CTAB. The absence of β-mercaptoethanol did not influence the quality of the extracted DNA. PCR demonstrated that DNA extraction using the eight tested protocols allowed for amplification with both ISSR markers. The eight protocols were able to extract amplifiable C. gladiatorium DNA, and may thus all be indicated for future molecular studies on the species. Catasetum gladiatorium é endêmica do Brasil e localiza-se em regiões com perturbações ambientais que podem afetar sua diversidade genética. Análises de diversidade genética necessitam de DNA integro, obtido por meio de protocolos de extração rápidos e eficientes. Este estudo objetivou propor um protocolo eficiente para a extração de DNA de C. gladiatorium, para uso em futuras análises moleculares. O DNA foi extraído do tecido foliar com oito protocolos baseados no método CTAB. Testou-se o tipo de trituração do material vegetal (com tampão STE e nitrogênio líquido) e a concentração de CTAB (2% e 5%) e de β-mercaptoetanol (0% e 2%) no tampão de extração. O DNA extraído foi submetido a amplificação com dois primers ISSR. Os métodos de trituração do material vegetal influenciaram na qualidade e quantidade de DNA extraído de C. gladiatorium. A trituração com nitrogênio líquido permitiu a extração de DNA de boa qualidade em todas as demais variações dos protocolos testados, enquanto a trituração com STE possibilitou a extração de DNA com baixa concentração e alta taxa de degradação. Melhores resultados foram obtidos com CTAB à 5%. A ausência de β-mercaptoetanol não influenciou a qualidade do DNA extraído. A amplificação via PCR, demonstrou que o DNA extraído com base nos oito protocolos testados foi passível de amplificação utilizando os dois marcadores ISSR selecionados. Os oito protocolos de extração testados foram capazes de extrair DNA passível de amplificação de C. gladiatorium, e podem ser indicados para futuros estudos moleculares da espécie