Estudos genômicos em Eucalyptus : mapeamento de genes candidatos e QTLs, estimativa de desequilíbrio de ligação e análise de estrutura de populações

As florestas plantadas com espécies do gênero Eucalyptus e seus híbridos constituem a base da produção nacional de celulose, papel e carvão vegetal. Estes setores envolvem empresas que executam melhoramento genético visando o aumento da produtividade e qualidade produção de matéria prima florestal em nível altamente competitivo. Neste cenário o uso de tecnologias genômicas associadas às estratégias de melhoramento genético convencional pode acelerar e aumentar a eficiência de todo o processo de melhoramento. Este trabalho envolveu um conjunto de experimentos visando gerar informações para estudos de genética de associação no gênero Eucalyptus no Brasil. Foram estudadas seis espécies pertencentes ao gênero Eucalyptus utilizadas no melhoramento florestal no Brasil (E. grandis, E. camaldulensis, E. urophylla, E. globulus, E. dunnii e E. saligna). Além das espécies puras, foram também avaliados clones híbridos espontâneos utilizados em plantios operacionais. Trechos de genes candidatos selecionados foram seqüenciados em amostras populacionais destas espécies. A identificação de genes e regiões genômicas para futuros estudos de associação foi realizada utilizando mapeamento de QTLs para diferentes características (volume, densidade básica, altura, DAP, relação siringil:guiacil, teor de lignina e rendimento depurado) em uma família envolvendo parentais híbridos (E. dunnii x E. grandis) X (E. urophylla x E. globulus). No mapa genético gerado com microssatélites foram posicionados os genes candidatos COMT, C4H, SAMS, Celulose Synthase, CCR, F5H, MYB PAL, Alfatubulina, entre outros utilizando SNPs genotipados via sequenciamento. No total, foram encontrados 12 QTLs para todas as características. O grupo de ligação com a maior concentração de QTLs encontrados foi o grupo seis. O mapeamento de genes candidatos foi uma estratégia válida, pois foram encontrados dois genes (SAMS e Alfatubulina) co-localizados em um intervalo contendo QTLs para características correlacionadas. A estrutura genética existente nas amostras populacionais das seis espécies foi avaliada com o programa STRUCTURE com base em 35 locos microssatélites nucleares, 11 locos microssatélites cloroplastidiais e SNPs também pertencentes ao genoma cloroplastidial. Os marcadores moleculares revelaram uma clara diferenciação entre espécies e procedências dentro de espécies geograficamente separadas, mas não para procedências próximas. Tanto os dados moleculares autossômicos, como os dados de cloroplasto mostraram uma alta diversidade genética nas seis espécies do gênero Eucalyptus. Os clones híbridos avaliados para os mesmos marcadores (microssatélites nucleares e cloroplastidiais; e SNPs) foram alocados quanto à sua origem híbrida, nas espécies E. grandis e E. urophylla. Os marcadores no cloroplasto revelaram uma origem materna predominante de E. grandis. Estimativas de desequilíbrio de ligação (DL) derivadas de marcadores SNPs revelaram que o DL em regiões gênicas não se estende além de 1000 pares de base. As estimativas de DL, entretanto variam dependendo do gene analisado e da espécie. De maneira geral, E. grandis e E. camaldulensis apresentaram as menores extensões de DL. E. dunnii e E. globulus, apresentam polimorfismos altamente correlacionados e em DL por até 1000 pb. Para a espécie E. saligna, a extensão do DL ao longo do gene CAD é intermediária em relação às demais espécies. Já para o gene 4CL, os indivíduos analisados pertencentes a esta espécie, demonstraram correlações significativas entre os polimorfismos identificados, estendendo assim o DL por até 900 pares de base. Os clones também avaliados quanto à extensão do desequilíbrio de ligação, apresentaram extensões similares por até 400 a 500pb nos dois genes avaliados. Porém no gene 4CL, os valores da correlação entre os SNPs par a par (r2) foram muito maiores do que os valores encontrados no gene CAD. Levando em consideração a rápida queda do desequilíbrio de ligação reportada aqui para o gênero Eucalyptus, a associação entre genótipos e fenótipos encontrada via mapeamento de QTLs em uma determinada família não pode ser estendida para outra família. Novas técnicas de seqüenciamento e genotipagem em larga escala vêm aumentando o número de marcadores disponíveis para uso na seleção assistida por marcadores.Cellulose and charcoal dependent industries in Brazil are based on commercial eucalyptus forests developed during the last fifty years in a well established and highly competitive breeding program looking for improvements in lignin or cellulose. Genomic based technologies bring to these programs the promise to improve gains in time and productivity. DNA markers discovery and their application in linkage mapping and association mapping represent the basic application of genomics in any organism breeding program. This work involved a series of experiments in order to generate information for genetic association studies in Eucalyptus. We studied six species of the genus Eucalyptus used in breeding programs in Brazil (E. grandis, E. camaldulensis, E. urophylla, E. globulus, E. saligna and E. dunnii). Besides of pure species, expontaneous hybrid clones, used in operational plantations, were also evaluated. Fragments of selected candidate genes were sequenced on these species. The identification of genes and genomic regions for future association studies were performed using QTL mapping for traits related to growth and wood quality in a cross involving hybrid parents (E. dunnii x E. grandis) X (E. urophylla x E. globulus). The genetic map generated with microsatellites was used to position candidate genes as, COMT, C4H, SAMS, Cellulose Synthase, CCR, F5H, MYB PAL, Alpha tubulin, among others, using SNPs genotyped by sequencing. A total of twelve QTLs were found representing all phenotypes investigated with exception to wood density measured by NIRS. Both parental maps showed a high number of QTLs mapped to linkage group number six. Among the candidate genes, two of them (SAMS and alfa-tubulin) were mapped in QTL intervals. Candidate gene mapping in QTLs intervals showed to be a good strategy to select genes or regions to be included in association mapping. Marker-assisted selection based on longrange marker-trait association detected by QTL analysis may only be useful within family selection. Population genetic structure was evaluated using 35 autosomal, 11 chloroplast microsatellites loci, besides single nucleotide polymorphisms from chloroplast genome. Both autosomal and chloroplast markers show that samples analyzed have a population structure based on species level and in some cases also in provenance level. Structured species based on provenance are those from distinct Australian latitudes. For all kind of markers analyzed, the six species showed high level of genetic diversity. Hibryd clones evaluated using the same molecular markers were allocated as having their origin in E. grandis e E. urophylla. Specifically about the maternal origin, chloroplast markers pointed to E. grandis. The results of genetic population structure investigated here shows that we have to pay special attention in hybrids to avoid spurious marked-trait association, since these hybrids are the most used breeding population in Brazil. The genes CAD and 4CL, both from the lignification pathway were resequenced in DNA samples from species and also in hibryd clones. In general, significant linkage disequilibrium (LD) has been found no longer than 1000 bp. The results were distinct based on gene or specie evaluated. For CAD gene: E. grandis and E. camaldulensis showed rapidly LD decay. However, in E. dunnii and E. globulus the decay does not start until 1000 bp. In E. saligna, the LD showed intermediate values compared to other species. For 4CL gene: E. saligna presented no LD decay in short distances when compared to the others species. For the hybrids, the LD decay found was similar to that found in species, in the 4CL gene analysis, the LD decay was slower than in the CAD gene. Considering the rapid decay of LD reported here for Eucalytpus, the marked-trait association detected in one segregating population cannot be assumed to hold in a different pedigree. The great challenge in the application of marker-assisted selection, is the low level of linkage disequilibrium between genetic markers and QTLs in natural and breeding populations. Next generation sequencing and highthroughput genotyping strategies will increase the number of molecular markers available for use in marker-assisted selection and this study aims to elucidate the genetic basis of association studies in Eucalyptus