Unravelling the genetic control of combined biotic/abiotic stress resistance in Phaseolus vulgaris L. The fusarium wilt - drought interaction

Tesis Doctoral.-- Dissertation presented to obtain the Ph.D degree in Plant Sciences - Plants for Life Instituto de Tecnologia Química e Biológica António Xavier, Universidade Nova de Lisboa.[EN] Common bean (Phaseolus vulgarisL.) is among the most important grain legumes for human consumption worldwide. Portugal has a promising commonbeangermplasmthat resultedfrom more than five centuries of natural adaptation and farmers’selection. Nevertheless, limited characterization of this resource hampers its exploitationby breeding programs. To support a more efficient conservation of the national beangermplasm and promote its use in crop improvement, we performed, for the first time, asimultaneous molecular marker and seed and plant morphological characterization of 175accessions collected from Portuguese mainland and islands traditional bean-growing regions.Most of the Portuguese accessions grouped with theracerepresentatives and wild relatives from the Andean region. One-third of the nationalgermplasmhad an admixed genetic origin andmight represent putative hybrids among genepools from the two original centers of domestication in the Andes and Mesoamerica. Themolecularmarker-based classification was largely congruent with the threemost frequentphaseolin haplotype patterns observed in the accessions analyzed.Additionally, we developed a core collection with 37 accessions that, by maximizing the genetic and morphological diversity of the original collection, represents the Portuguese common bean germplasm with minimum repetitiveness.Fungal diseases, such as fusarium wilt, and water deficit are among the major constraints to common bean production worldwide, limiting yield, farmer’s income, and commercialization. Toidentify new sources of fusarium wilt resistance and detect resistance-associated SNPs, we explored, for the first time, the Portuguese diverse common bean germplasmusing genome-wide association analyses. The collection was evaluated for fusarium wilt resistance under growth chamber conditions, using the highly virulent Fusarium oxysporumf. sp. phaseoli(Fop) strain, FOP-SP1 race 6. Fourteen accessions were considered highly resistant and71 intermediate. The same collection was genotyped with single nucleotide polymorphism (SNP)-based arrays and SNP-resistance associations were tested using a mixed linear model accounting for the genetic relatedness among accessions.The results from the genome-wide association study (GWAS) revealed nine SNPs associated with resistance oncommon beanchromosomes Pv04, Pv05, Pv07, and Pv08, indicating that fusarium wilt resistance is under oligogenic control. Putative candidate genes related to phytoalexinsbiosynthesis,hypersensitive response, and plant primary metabolism were identified. Moreover, photosynthesis-related traits, namely leaf gas exchange parameters and photosynthetic pigments,were evaluated in the same Portuguese common bean collection, under both well-watered(WW)and water-deficit(WD)conditions.Once again, the natural variation of the collection was explored and a GWAS performed to identify SNP alleles and candidate genes associated withthe studiedphotosynthesis-related traits. A total of 133 SNP-trait associations were identified for net CO2assimilation rate, transpiration rate, and stomatal conductance, and for chlorophylls aand b, carotenes and xanthophylls contents. Ninety of these associations were detected under WDand 43 under WWconditions. The identified candidate genes revealed that stomatal regulation, membrane translocation of proteins, mechanisms of redox, hormone and osmotic stress signaling were the most relevant processes related to the studied common bean response to water deficit.Finally, to understand the unique and shared responses of common bean to Fopand WDstresses, we characterizedthe differentially expressed genes in a double resistant and a double susceptible accessionwhen these stresses were appliedsinglyor combined. The susceptible accession revealed a clearly higher level of transcriptional changes in relation to the control condition, in all the three treatments –Fopand WD single stresses and in the combined FopWD stress -compared with the resistant accession (944 versus 228 differentially expressed genes (DEGs)).The most represented functional categories within the DEGs were “RNA”, “secondary metabolism”, “stress”, “signaling”, “hormone metabolism”, “transport”, “protein” and “cell wall”. The resistance-related genes found might be targets for functional characterization and development of molecular tools, to expedite the screening and improvement of common bean multiple resistance to biotic and abiotic stresses.In conclusion, the work developedunder this Ph.D. thesisunlocked the door of futurecommon beanbreeding in Portugal, improved the knowledge on the molecular and morphological characterization of this national resource,identified new sources of resistance to a highly virulent Fopisolate and accessions more tolerant to WD conditions,and unveilthe genetic control of disease resistance and photosynthesis-relatedtraits in common bean.[PT] O feijão comum (Phaseolus vulgarisL.), ou simplesmente feijão, está entre as leguminosasde grão mais importantes para consumo humano em todo o mundo. Portugal possui um germoplasma de feijão com grande potencial, resultante da adaptação natural edaseleção efetuada pelos agricultores ocorridasnos últimos cinco séculos. No entanto, a caracterização desse recurso é limitada, o que dificulta a sua utilização em programas de melhoramento. Para promover uma conservação mais eficiente do germoplasma nacional de feijão e fomentar o seu uso em programas de melhoramento, foi realizado, pela primeiravez neste trabalho de doutoramento, uma caracterização molecular e morfológica de sementes e plantas de 175 acessos de feijão colhidos em diferentes regiões de Portugal continental e ilhas. A classificação baseada em marcadores moleculares foi amplamente congruente com os três haplótipos de faseolina mais frequentemente observados nos acessos analisados. A maioria dos acessos portugueses agrupou-se com os acessos representantes da região andina. Um terço do germoplasma nacional tem uma origem genética mista, sendo híbridos putativos entre os grupos genéticos dos dois centros originais de domesticação desta espécie, Andes e Mesoamérica. Adicionalmente,foi desenvolvida uma coleção nuclearcom 37 acessos, representativa da diversidade genética e morfológica da coleção original de feijão português.As doenças fúngicas, como a fusariose, e a secaestão entre os principais problemas que o cultivo de feijão enfrenta em todo o mundo, limitando a sua produção, o lucro do agricultor e a comercialização. Para identificar novas fontes de resistência à fusariose e detectar alelos de marcadores molecular associados a genes de resistência, foi explorada, pela primeira vez, a diversidade natural presente no germoplasma de feijão português, utilizando o mapeamento por associação ao longo de todo o genoma de feijão (GWAS, genome-wide asssociation study, em inglês). A coleção de acessos de feijão foi avaliada quanto à resistência à fusariose, numa câmara de crescimento de plantas com condições controladas, utilizando um isolado muito virulento de Fusarium oxysporumf. sp. phaseoli(Fop), denominado FOP-SP1 raça 6. Catorze acessos foram considerados altamente resistentes e 71 intermédios.A mesma coleção foi genotipada com arraysbaseados em polimorfismo de nucleotídeo único (SNP, single-nucleotide polymorphism,em inglês) e as associações entre os níveis de resistência e os alelos dos SNPs foram testadas usando um modelo linear misto, tendo em conta a relação genética entre os acessos. Os resultados do estudo de associação (GWAS) revelaram alelos de nove SNPs associados à resistência à fusariose nos cromossomas de feijão Pv04, Pv05, Pv07 e Pv08, indicando que esta resistência está sob controlo oligogénico. Foram identificados genes candidatos envolvidos na biossíntese de fitoalexinas, resposta hipersensitivae metabolismo primário da planta.Adicionalmente foram avaliadas,na mesma coleção de feijoeiros,características relacionadas com a fotossíntese, nomeadamente parâmetros relacionados com as troca gasosas foliares e com os pigmentos fotossintéticos, em condições bem irrigadas (WW, well-wateredem inglês) e em déficit hídrico (WD, water deficitem inglês). Uma vez mais, a variação natural da coleção de acessos de feijão foi explorada e um GWAS realizado para identificar alelos de SNPs e genes candidatos associados a características relacionadas com a fotossíntese. Foram identificadas 133 associações entre os alelos dos SNPs e as taxas de assimilação líquida de CO2e de transpiração, a condutância estomática, e o conteúdo em clorofilas ae b, e em carotenos e xantofilas. Noventa destas associações foram detetadas em condições bem irrigadas e 43 em déficit hídrico. Os genes candidatos identificados revelaram que a regulação estomática, a translocação de proteínas pelas membranascelulares, os mecanismos de redox, a sinalização de stresses hormonal e osmótico foram os processos mais relevantes relacionados com a resposta do feijoeiro ao déficit hídrico estudado.Finalmente, com o objetivo de estudar as respostas comuns eúnicas do feijoeiro à fusariose e ao déficit hídrico, foram identificados os genes diferencialmente expressos em dois acessos –um resistente e um suscetível a ambos os stresses –quando os stresses foram aplicados isoladamente ou em combinação. O acesso suscetível revelou um nível notoriamente mais elevado de alterações transcricionais em comparação com o acesso resistente, nos três tratamentos aplicados –stresses individuais de Fope WD e no stress combinado FopWD.As categorias funcionais mais representadas nos genes identificados foram "ARN", "metabolismo secundário", "stress", "sinalização", "metabolismo hormonal", "transporte", "proteína" e "parede celular". Os genes identificados envolvidos na resistência das plantas serão alvos preferenciais para a caracterização funcional e para o desenvolvimento de ferramentas moleculares que auxiliem o desenvolvimento de acessos de feijão com resistência múltipla a stresses bióticos e abióticos.Em conclusão, o trabalho descrito nestatese de doutoramento (Ph.D.) abriu caminhopara que se desenvolva um programa de melhoramento de feijão em Portugal com vista ao desenvolvimento de variedades mais adaptadas a múltiplosstresses.Foi caracterizada a diversidade molecular e morfológica deste recurso genético nacional, identificadasnovas fontes de resistência a Fusariume de tolerânciaacondições de déficit hídrico,e ampliou-se oconhecimento existente docontrolo genético da resistência a doenças fúngicas e de características relacionadas com a fotossíntese no feijoeiro