Differential splicing and allelic imbalance as pathomechanisms of recurring mutations in Acute Myeloid Leukemia

Acute myeloid leukemia is an aggressive malignancy which proves fatal if left untreated. Most patients respond to intensive chemotherapy, however refractory or relapsing disease is still a major contributor of poor patient outcome. New generation sequencing methods enabled the identification of genes harboring recurrent mutations in this disease, and they are being used to inform clinical decisions. In the studies presented in this thesis the aim was to improve our understanding of these mutations to further refine clinical decision making. The first study provided an overview of splicing factor mutations, which affect around 20% of all acute myeloid leukemia patients. It highlighted the association of splicing factor mutations with clinical and molecular parameters and further showed that splicing factor mutations are not independent prognostic markers in acute myeloid leukemia. A novel differential splice junction usage pipeline was used to quantify aberrant splicing patterns in mutated patients in two large sequencing datasets. The usage of two splice junctions was shown to identify patients with poor prognosis thereby providing an example of how our findings can be translated to clinical practice. The purpose of the second study was to examine allelic imbalance of recurrent mutations, a currently underappreciated phenomenon in acute myeloid leukemia. Using a large patient sample pool with matched DNA- and RNA-sequencing data we were able to compare variant calling pipelines between both sequencing methods to determine whether recurrent mutations are over- or underrepresented in RNA. We defined weighted allelic imbalance as a parameter for statistically comparing variant allele frequencies between DNA and RNA and identified allelic imbalance in nine out of eleven recurrently mutated genes examined in this study. Furthermore, recurrent mutations in GATA2 were also shown to exhibit preferential transcription for the mutant allele in a pooled validation cohort of three independent datasets. In summary, our studies show how customized bioinformatics pipelines can lead to an improved pathomechanistic understanding of recurrent mutations in acute myeloid leukemia and provide a foothold for further study of these mutations in high throughput sequencing experiments.Die Akute Myeloische Leukämie ist eine aggressive Krebserkrankung die unbehandelt tödlich verläuft. Die Mehrheit der Patienten spricht auf eine intensive Chemotherapie an, jedoch resultieren refraktäre Erkrankungsverläufe oder Rezidive immer noch in einer schlechten Gesamtprognose. Hochdurchsatz-Sequenzierungsverfahren erlaubten die Identifikation von Genen, die in dieser Erkrankung häufig mutiert sind. Diese Mutationen ermöglichen eine Risikostratifizierung der Patienten und fließen in Therapie-Entscheidungen ein. Das Ziel der in dieser Dissertation präsentierten Studien war es, die funktionelle Bedeutung einiger dieser Mutationen genauer zu charakterisieren. Die erste Studie charakterisierte Spliceosom-Mutationen, die bei etwa 20% aller Patienten mit einer Akuten Myeloischen Leukämie beobachtet werden. Die Assoziation von Spliceosom-Mutationen mit klinischen und molekularen Parametern wurde untersucht und zeigte, dass Spliceosom-Mutationen keine unabhängige prognostische Wertigkeit besitzen. Eine neue Analyse-Methode zur Splicing-Quantifizierung wurde zur Untersuchung von aberranten Splicing-Mustern in Patienten mit Mutationen in diesen Genen entwickelt. Diese wurde in der Folge auf zwei große Sequenzierdatensätze angewandt. Zwei der aberranten Splicing-Muster konnten genutzt werden, um Patienten mit einer schlechten Prognose zu identifizieren und stellen damit die klinische Bedeutung der Ergebnisse beispielhaft dar. Das Ziel der zweiten Studie war es, ein allelisches Ungleichgewicht von häufigen Mutationen zu untersuchen. Mittels eines großen Patientenkollektivs mit gepaarten DNA- und RNA-Sequenzierungsdaten konnten eine Über- oder Unterrepräsentation von häufigen bei AML Patienten beobachteten Mutationen auf RNA-Ebene bestimmt werden. Wir definierten die “weighted allelic imbalance” als einen Parameter für den statistischen Vergleich der Allelfrequenzen von rekurrenten Mutationen in DNA und RNA und stellten ein allelisches Ungleichgewicht in neun von elf untersuchten Gen-Mutationen fest. Weiterhin konnte die bevorzugte Transkription des mutierten Allels von GATA2 in einer Validierungskohorte, bestehend aus drei unabhängigen Datensätzen, gezeigt werden. Zusammenfassend, zeigen diese Studien wie maßgeschneiderte bioinformatische Arbeitsabläufe zu einem verbesserten pathomechanistischen Verständnis von rekurrenten Mutationen in der Akuten Myeloischen Leukämie führen können und stellen einen Baustein für die weitere Erforschung solcher Mutationen mit Hilfe von Hochdurchsatz-Experimenten dar