Entwicklung bioanalytischer Methoden zur quantitativen und qualitativen Analyse von markierten Peptiden und Proteinen durch Kopplung von Chromatographie und Massenspektrometrie

This PhD thesis was a Cotutelle between the Université de Pau et des Pays de l’Adour (UPPA) in Pau, France and the Christian-Albrechts University (CAU) in Kiel, Germany. In the course of this international collaboration, bio-analytical methods for the quantitative and qualitative analysis of labelled peptides and proteins were developed, which were based on the hyphenation of chromatography with mass spectrometry. Peptides and protein digests were lanthanide labelled using DOTA-based compounds according to an optimised protocol. Separation on the peptide level was performed using IP-RP-nanoHPLC. Complementary data sets were acquired using MALDI-MS for identification and ICP-MS for quantification. In this context, an online precleaning step was developed and implemented in the nanoHPLC separation routine, which allowed for effective removal of excess reagents. This lead to lowered metal backgrounds during ICP-MS measurements and thus better data interpretability, while guarding peptide recovery at a maximum level. An alternative offline purification using solid phase extraction (SPE) resulted in important peptide losses and can be considered unsuitable for quantitative analysis. Additives to the nanoHPLC eluents, such as HFBA and EDTA were tested and not deemed beneficial for the analysis of normal peptide samples. HFBA can be reconsidered for special application on very hydrophilic peptide species. A set of labelled peptides was developed, which due to application of known quantities could be employed for quick and simple quantification of a low complexity digest sample. In addition this peptide set allowed for the reliable superposition of chromatograms, enabling sample comparability especially for complementary ICP-MS and MALDI-MS data. Experiments for application of fsLA-ICP-MS on MALDI-MS target plates were conducted and showed very promising results. For this purpose, samples that were already identified using MALDI-MS were supposed to be remeasured using fsLA-ICP-MS. First quantification attempts on the modified steel target plate were successful and in the range of expectance. Adjusted parameters for MALDI-MS allowed for proper peptide identifications.Diese Dissertation entstand im Rahmen einer Cotutelle zwischen der Université de Pau et des Pays de l’Adour (UPPA) in Pau, Frankreich und der Christian-Albrechts Universität zu Kiel (CAU), Deutschland. Während dieser internationalen Zusammenarbeit wurden bioanalytische Methoden für die quantitative wie qualitative Analyse markierter Peptide und Proteine erarbeitet. Die Arbeiten basierten auf der Kopplung von Chromatographie und Massenspektrometrie. Peptide und Proteinverdaue wurden nach einem optimierten Protokoll mit DOTA-basierten Verbindungen lanthanid-markiert. Die Separation auf Peptidebene wurde mittels IP-RP-nanoHPLC durchgeführt. Komplementäre Datensätze wurden mittels MALDI-MS zur Peptidindentifizierung und mittels ICP-MS zur Quantifizierung erstellt. In diesem Rahmen wurde ein online Aufreinigungsschritt zur effektiven Entfernung von Reagenzüberschüssen entwickelt und in die nanoHPLC Trennungsmethode implementiert. Dies führte zu niedrigeren Metallhintergrundwertem in nanoHPLC-ICP-MS Messungen und einer besseren Interpretierbarkeit der Daten, gleichzeitig konnten die Peptidausbeuten auf höchstem Niveau erhalten bleiben. Alternative offline Reinigung mittels Festphasenextraktion (SPE) verursachte beträchtliche Verluste in den Peptidausbeuten und konnte für quantitative Analysen als ungeeignet erachtet werden. Die Zumischung verschiedener Substanzen, wie HFBA und EDTA zu den Eluenten der nanoHPLC wurde untersucht und für die Analyse normaler Peptidproben als wenig nutzbringend befunden. HFBA kann dennoch eventuell für Spezialanwendungen auf besonders hydrophile Peptide in Betracht gezogen werden. Ein Satz markierter Peptide wurde zusammengestellt, welcher durch Verwendung bekannter Mengen für eine schnelle und einfache Quantifizierung einer wenig komplexen Probe eingesetzt werden konnte. Zudem konnten diese Peptide dazu verwendet werden, eine zuverlässige Überlagerung von Chromatogrammen zu erwirken und damit die Probenvergleichbarkeit speziell zwischen ICP-MS und MALDI-MS sicher zu stellen. Versuche zur Anwendung von fsLA-ICP-MS auf MALDI-Stahlplatten wurden durchgeführt und zeigten vielversprechende Ergebnisse. Hierzu sollten bereits mit MALDI-MS identifizierte Proben, erneut mittels fsLA-ICP-MS gemessen werden. Erste Quantifizierungsversuche auf modifizierten MALDI-Platten waren erfolgreich. Angepasste MALDI-MS Parameter ermöglichten eine eindeutige Peptididentifikation