Investigating the structure-function relationship of the USP19 deubiquitinating enzyme in muscle cell differentiation «in vitro»

Muscle wasting is a common complication of aging and a number of chronic and degenerative diseases. Previous work has demonstrated that the deubiquitinating enzyme (DUB) USP19 is induced at the mRNA level in atrophying rat skeletal muscle under various conditions of catabolism [1]. To further explore USP19's role in muscle, loss of function approaches were employed. siRNA-mediated silencing of USP19 in L6 muscle cells enhanced the expression of a panel of major myofibrillar proteins and the myogenic regulatory factor myogenin that regulates muscle differentiation [2]. The enhanced expression of MHC and tropomyosin upon USP19 depletion was found to be dependent on USP19's regulation of myogenin. The effects observed upon USP19 depletion may be due to an effect on muscle cell differentiation. USP19 is expressed as two major isoforms, one with and the other without a C-terminal transmembrane domain (TMD) that confers ER localization. Therefore, I characterized the mechanism by which USP19 modulates muscle cell differentiation and examined the structure-function relationship of USP19 in regulation of this process. The negative role of USP19 in muscle cell differentiation was confirmed as adenovirus-mediated overexpression of wild type USP19 in C2C12 muscle cells suppressed the protein levels of MHC, tropomyosin, and myogenin at the molecular level and inhibited myotube fusion morphologically. These effects are dependent on USP19's DUB catalytic activity and localization to the ER as overexpression of a catalytically inactive mutant or the non-ER localized USP19 isoform abolished these molecular and morphological effects. USP19 N-terminal domains appear to be important for suppression of myotube fusion, as overexpression of USP19 mutants lacking various N-terminal regions weakened the fusion defect observed in wild type USP19 expressing cells, but did not affect myogenin expression. The inhibition of myoblast fusion upon overexpression of wild type USP19 coincided with a decrease in the induction of ER stress required for myogenesis as assessed by the number of CHOP positive cells and ER stress treatment of wild type USP19 expressing cells recovered the fusion defect, suggesting a differentiation-dependent role for USP19 at the ER. The regulation of USP19 was investigated to observe if USP19 isoforms are uniquely regulated during myogenesis. Total USP19 protein expression in C2C12 cells increased ~ 1.6 fold over six days of differentiation, while the mRNA levels of the USP19ΔTMD and USP19TMD isoforms increased ~ 2.5 fold and ~ 1.4 fold, respectively. USP19 was also demonstrated to interact with USP9X and suppress IGF1/PI3K/mTOR/Akt growth signaling. Collectively, these results implicate USP19 as a negative regulator of muscle cell differentiation dependent on its DUB catalytic activity and ER localization. Dysregulated or suppressed myogenesis contributes to muscle atrophy as well as a delayed recovery following injury, identifying USP19 inhibition as a novel therapeutic intervention for the treatment of muscle atrophy.La perte musculaire est une complication fréquente du vieillissement et d'un grand nombre de maladies chroniques et dégénératives. Des travaux antérieurs ont démontré que l'enzyme de déubiquitination (DUB) USP19 est induite au niveau de l'ARNm durant l'atrophie du muscle squelettique de rat dans diverses conditions cataboliques [1]. Pour explorer davantage le rôle de USP19 dans les muscles, des approches de perte de fonction ont été employées. En utilisant le silençage génique médié par des siRNA contre USP19 dans des cellules musculaires L6, une augmentation de l'expression de plusieurs protéines myofibrillaires ainsi que de la myogénine, un facteur de régulation de la différenciation musculaire, a été observée [2]. L'expression accrue de la MHC et de la tropomyosine suite à l'inhibition de USP19 s'est révélée être dépendante de la régulation de la myogénine par USP19. Les effets observés suite a l'appauvrissement de USP19 pourrait être dû à un effet sur la différenciation des cellules musculaires. USP19 est exprimée sous forme de deux isoformes majeures, l'une avec et l'autre sans domaine transmembranaire C-terminal (TMD) qui confère la localization dans le réticulum endoplasmique (ER). Par conséquent, j'ai caractérisé le mécanisme par lequel USP19 module la différenciation des cellules musculaires et examiné la relation structure-fonction de USP19 dans la régulation de ce processus. Le rôle négatif de USP19 dans la différenciation des cellules musculaires a été confirmé par la surexpression de USP19 de type WT en utilisant des adénovirus dans les cellules musculaires C2C12. La surexpression de USP19 a provoqué la suppression des niveaux de protéines de la MHC, de la tropomyosine et de la myogénine et inhibé morphologiquement la fusion des myotubes. Ces effets dépendent de l'activité catalytique et de la localisation de USP19 dans le ER puisque la surexpression d'un mutant catalytiquement inactif ou d'un isoforme non-ER localisé aboli ces effets moléculaires et morphologiques. Les domaines N-terminaux de USP19 semblent aussi être importants pour la suppression de la fusion des myotubes, étant donné que la surexpression de mutants USP19 dépourvus de diverses régions N-terminales atténue l'effet de la fusion cellulaire observée dans les cellules exprimant le USP19 de type WT, mais n'a pas d'incidence sur l'expression de la myogénine. L'inhibition de la fusion des myoblastes exprimant le USP19 de type WT coïncide avec une diminution de l'induction du stress relié au réticulum endoplasmique démontré par le nombre de cellules positives pour CHOP qui est nécessaire à la myogenèse. Le traitement de cellules exprimant USP19 de type WT avec un inducteur du stress relié au ER récupère le défaut de fusion, ce qui suggère un rôle pour USP19 dans la differentiation cellulaire relié au stress du ER. La régulation de USP19 a été étudiée pour observer si les isoformes USP19 sont modulés uniquement pendant la myogenèse. L'expression protéique globale de USP19 dans des cellules C2C12 est augmentée ~1,6 fois sur six jours de différenciation, tandis que les taux d'ARNm de ΔTMD et TMD sont augmentés ~2,5 et ~1,4 fois, respectivement. Il a été également démontré que USP19 peut interagir avec USP9X et peut supprimer la voie de signalisation de la croissance IGF1/PI3K/mTOR/Akt. Collectivement, ces résultats impliquent USP19 comme un régulateur négatif de la différenciation cellulaire du muscle, dépendant de son activité catalytique et de sa localisation dans le ER. Une myogénèse mal régulée ou supprimée contribue à l'atrophie musculaire ainsi qu'à une convalescence prolongée suite à une blessure, identifiant ainsi l'inhibition de USP19 comme une intervention thérapeutique potentielle pour le traitement de l'atrophie musculaire