Role of the USP19 deubiquitinating enzyme in the activation of the ubiquitin proteasome system in skeletal muscle upon stimulation with dexamethasone

Loss of skeletal muscle occurs with muscle disuse, aging, and in many diseases such as sepsis, chronic obstructive pulmonary disease, chronic heart failure, AIDS, cancer and diabetes. The muscle loss results from decreased protein synthesis and increased degradation. The increase in protein degradation is dependent on the activation of the ubiquitin proteasome system (UPS), a pathway in which selected proteins are labeled with ubiquitin that targets them for degradation. Understanding the precise molecular pathways behind muscle wasting is critical for the development of new therapies to prevent or treat the loss of muscle mass and function associated with many diseases. Many studies have revealed roles for ubiquitin ligases in muscle wasting but little is known about the roles of deubiquitinating enzymes. Our laboratory has previously shown that the induction of USP19, a deubiquitinating enzyme, occurs under different conditions of muscle atrophy including fasting, glucocorticoid treatment, muscle denervation and cancer bearing animals. To further evaluate the role of USP19, our laboratory tested the effects of inactivating USP19 in mice in dexamethasone-induced atrophy. Under dexamethasone induced muscle atrophy, USP19 KO mice lost 64% less tibialis anterior muscle mass than WT mice. In addition, the induction of atrophy genes, ubiquitin ligases MuRF1 and atrogin-1 seen in muscles in WT mice was significantly attenuated in the KO mice. Since these mice were deficient in USP19 in all tissues, I tested in this thesis whether USP19 could act directly on muscle cells. I first screened multiple muscle cell lines to identify ones in which dexamethasone could induce expression of atrogenes. To explore whether these muscle protective effects are likely due to the direct action of USP19 in muscles, I tested the effect of silencing USP19 in myotubes exposed to dexamethasone. Our results show that silencing USP19 in L6 myotubes attenuated the induction of atrophy genes, MuRF1 and atrogin-1, by dexamethasone. Another approach to loss of function is testing the effect of dexamethasone in USP19 KO primary myotubes. Primary myoblasts were isolated from tibialis anterior muscle of USP19 KO mice, and myoblasts were induced to differentiate. Our results show that the inactivation of USP19 in the primary culture attenuated the expression of MuRF1 in both basal and dexamethasone treated states, but had no effect on expression of atrogin-1. Taken together, these results indicate that USP19 modulates muscle atrophy in part by a direct action in skeletal muscle and suggest that inhibition of USP19 may be useful for the prevention of glucocorticoid-induced muscle atrophy.La perte de muscle squelettique se produit suite à l’immobilité ou au vieillissement ou suite à certaines maladies comme la septicémie, le syndrome pulmonaire obstructif, l’insuffisance cardiaque, le SIDA, le cancer et le diabète. La perte musculaire est causée par une diminution de la synthèse protéique et une augmentation de la dégradation. L’élévation de la protéolyse dépend de l’activation du système ubiquitine-protéasome (UPS), une voie dans laquelle des protéines sont sélectionnées, étiquetées avec l’ubiquitine et ciblées pour la dégradation. Il est important de comprendre en détail les voies moléculaires menant à l’atrophie musculaire afin de développer de nouvelles thérapies pour contrer la perte d’activité et de masse musculaire associée à ces maladies.Plusieurs études ont démontré un rôle pour des enzymes de ligation à l’ubiquitine dans l’atrophie musculaire mais il existe peu de détails quand à l’implication des enzymes de déubiquitination dans ce processus. Notre groupe a précédemment montré que l’induction de USP19, une enzyme de déubiquitination, survient sous différentes conditions d’atrophie musculaire comme le jeûne, le traitement aux glucocorticoïdes, la dénervation musculaire et le cancer. Afin d’évaluer davantage le rôle de USP19, notre laboratoire a testé les conséquences de l’inactivation du gène USP19 chez la souris dans l’atrophie induite par le dexamethasone. Suite au traitement avec le dexamethasone, les souris USP19 KO ont perdu 64% moins de masse musculaire dans leur muscle tibialis antérieur que les souris WT. De plus, l’induction des gènes liés à l’atrophie, MuRF1 et Atrogin-1 (enzymes de ligation à l’ubiquitine) observée dans les muscles de souris WT est significativement atténuée chez les souris KO.Etant donné que ces souris ont le gène USP19 inactivé dans tous les tissus, j’ai testé, dans le cadre de cette thèse, si USP19 peut agir directement dans les cellules musculaires. J’ai d’abord exploré plusieurs lignées cellulaires afin de déterminer quelles lignées sont capables d’induire les gènes d’atrophie sous traitement au dexamethasone. Pour vérifier si l’effet protecteur observé dans le muscle est possiblement du à une action directe de USP19, j’ai testé l’inactivation de USP19 par silençage génique dans des myotubes traités au dexamethasone. Les résultats démontrent que le silençage de USP19 dans des myotubes L6 atténue l’induction des gènes liés à l’atrophie, MuRF1 et Atrogin-1, après traitement au dexamethasone.Un autre moyen de tester la perte de fonction de USP19 est de soumettre des myotubes primaires venant de souris USP19 KO au dexamethasone. Les myoblastes primaires ont été isolés de muscles tibialis antérieurs de souris USP19 KO et WT et ont ensuite été induits à la différentiation. Nos résultats démontrent que l’inactivation de USP19 dans des myotubes primaires atténue l’expression de MuRF1 en condition basale ainsi qu’en présence de dexamethasone. Par contre, aucun effet sur l’expression de Atrogin-1 n’a été observé. En conclusion, ces résultats nous indiquent que USP19 peut moduler l’atrophie musculaire, du moins en partie, de façon directe dans le muscle squelettique. Ces résultats nous suggèrent aussi que l’inhibition de USP19 pourrait possiblement mener à la prévention de l’atrophie musculaire induite par les glucocorticoïdes