Evaluating CCAAT enhancer binding protein delta and the glucocorticoid receptor substrates of the USP19 deubiquitinating enzyme

Muscle atrophy occurs as a result of disuse, fasting, aging, many common diseases such as cancer, COPD and treatments such as glucocorticoids. Activation of the ubiquitin-proteasome system (UPS) and, in particular, the induction of several ubiquitin ligases appears to be a major cellular mechanism facilitating the increase in muscle protein breakdown and atrophy of the muscle fibers. However, the role of deubiquitinating enzymes remains poorly explored. Interestingly, we have identified ubiquitin-specific protease 19 (USP19) as a deubiquitinating enzyme that is upregulated in several conditions of muscle wasting[1]. Silencing of USP19 in cells increases expression of myofibrillar proteins[2], and its knockout in mice reduces the severity of muscle wasting in response to glucocorticoids, denervation and fasting[3]. These data indicate that USP19 plays an essential role in promoting muscle wasting, but the mechanisms underlying this effect is unknown. The transcription factor CCAAT Enhancer Binding delta (C/EBPδ) is upregulated in mouse muscle by glucocorticoid and can promote muscle atrophy by inducing myostatin[4, 5]. Importantly, this upregulation of C/EBPδ was blunted in USP19 knockout mice and the level of myostatin was also lower in KO mice compare to WT upon fasting. Therefore, we tested whether C/EBPd is a substrate of USP19. Results from co-expression, silencing and co-immunoprecipitation experiments suggested that USP19 does not interact with C/EBPδ and has no significant effect on its stability. We also observed decreased glucocorticoid signaling and lower levels of glucocorticoid receptor (GR) in USP19-KO mice compare to WT. Furthermore, the mRNA levels of GR were unaffected, suggesting that its rate of degradation is accelerated upon the loss of USP19. Therefore, we tested whether GR is a substrate of USP19. We found that the level of the GR is decreased in USP19 knockout HEK293T cells compared to wild-type cells. Conversely, the GR level is increased when it was co-expressed with USP19 isoforms. This effect was independent of USP19’s deubiquitinating activity, as a catalytically inactive USP19 mutant induced a similar increase in GR level as wild-type USP19. However, the catalytic domain of USP19 was required because a USP19 mutant missing this domain did not induce any significant change in GR level. Since the GR is a well-known client of HSP90[6] and the structure of USP19 contains two CS domains that are homologous to two co-chaperones of HSP90, SGT1 and p23, we tested whether USP19 regulates GR by interacting with HSP90. Co-immunoprecipitation experiments in HEK293 cells showed USP19 interacting with both HSP90 and GR. Removal of the two CS domains in USP19’s structure did not disrupt its interaction with HSP90 or GR. Therefore, USP19 may mediate its effects on GR by interacting with Hsp90 through its catalytic domain and assists HSP90 in stabilizing unbound GR. In conclusion, our studies argue that USP19 mediates its effects on muscle atrophy through GR.L’atrophie musculaire se produit lorsque les muscles sont inutilisés, lors d’un jeûne, avec le vieillissement, dans le cadre de maladies telles que le cancer, la MPOC ou encore lors de traitements tel que l’administration de glucocorticoïdes. L’activation du système ubiquitine-protéasome (UPS) et plus particulièrement l’induction de plusieurs ubiquitine ligases semble constituer un des mécanismes prépondérant pour augmenter la dégradation des protéines et l’atrophie musculaires. Toutefois, le rôle d'enzymes possédant une activité de dé-ubiquitination dans le contexte de l’atrophie musculaire demeure peu connu. Fait intéressant, nous avons identifié une protéase (USP19) possédant une activité de dé-ubiquitination qui est régulée positivement en réponse à une perte de masse musculaire associée à plusieurs conditions. La désactivation du gène codant USP19 dans les cellules produit une augmentation de l’expression des protéines myofibrillaires et l’inactivation de USP19 chez des souris réduit la sévérité de la perte musculaire en réponse à un traitement aux glucocorticoïdes, lors de la dénervation des muscles ou en conséquence d’un jeûne. Ces données suggèrent que USP19 joue un rôle primordial dans la régulation de la perte musculaire mais les mécanismes sous-jacents demeurent inconnus. Le facteur de transcription CCAAT Enhancer Binding delta (C/EBPδ) est régulé positivement dans les muscles souris traitées aux glucocorticoïdes et favoriserait l’atrophie musculaire via l’activation de la myostatine. Fait important, cette régulation positive de C/EBPδ est atténuée chez les souris knockout USP19 (KO-USP19) et les quantités de myostatine sont également plus faibles chez les souris knockout comparativement aux souris contrôles suivant un jeûne. En conséquence, nous avons testé l’hypothèse que C/EBPδ soit un substrat de USP19. Les résultats d’expériences de co-expression protéinique, de désactivation du gène et de co-immunoprécipitation suggèrent que USP19 n’interagit pas avec C/EBPδ et n’a aucun effet sur la stabilité de la protéine.Nous avons également observé une diminution de la signalisation activée par les glucocorticoïdes ainsi qu’une expression réduite du récepteur des glucocorticoïdes (GR) chez les souris KO-USP19 comparativement aux souris contrôles. De plus, les niveaux d’ARNm de GR n’étaient pas affectés, suggérant que la dégradation des récepteurs est accélérée en l’absence de USP19. Nous avons donc testé l’hypothèse que GR soit un substrat de USP19. Nous avons constaté que l’expression de GR est réduite dans les cellules HEK293T avec un gène USP19 inactif comparativement aux cellules exprimant le gène. Au contraire, l’expression de GR était augmentée lorsque co-exprimé avec différents isoformes de USP19. Cet effet était indépendant de l’activité de dé-ubiquitination de USP19 puisqu’un mutant inactivant la fonction catalytique démontrait une augmentation similaire de l’expression de GR comparativement à celle de USP19 non-muté. Toutefois, le domaine catalytique de USP19 était nécessaire pour provoquer cet effet puisqu’une forme mutante de USP19 n’exprimant pas le domaine catalytique n’affectait pas l’expression de GR. Étant donné l’interaction connue entre GR et HSP90 et que la structure protéinique de USP19 contient deux domaines CS homologues aux deux co-chaperons de HSP90, SGT1 et p23, nous avons testé l’hypothèse que USP19 peut réguler GR par interaction avec HSP90. Les expériences de co-immunoprécipitation dans les cellules HEK293 ont démontrées que USP19 interagit autant avec HSP90 et GR. L’ablation des deux domaines CS de la structure protéinique de USP19 n’a pas démontré d’impact sur l’interaction avec HSP90 ou GR. En conséquence, USP19 pourrait agir sur GR en interagissant avec HSP90 via son domaine catalytique et assister HSP90 à stabiliser GR non-lié. En conclusion, nos études suggèrent que l’interaction entre USP19 et GR est responsable des effets de USP19 observés sur l’atrophie musculaire