MicroRNA profiling of purified alveolar epithelial type II cells from normal mice

Alveolar epithelial type II (ATII) cells play an important role in the maintenance of alveolar homeostasis. During injury, loss or dysregulation, however, ATII cells can lead to lung fibrosis and cancer by epithelial-to-mesenchymal transition (EMT). The complex regulatory networks that maintain ATII cells under physiologic condition are still little understood. MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression at the posttranscriptional level. Hence, the goal of this study was to identify miRNAs expressed by murine ATII cells under normal, non-pathologic conditions and to elucidate potential miRNA-controlled pathways of ATII cell homeostasis. A new protocol was established to isolate “untouched” murine ATII cells by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) based on their autofluorescence (termed sATII). The purity and viability of sATII were compared to ATII cells obtained by the previously published isolation method “panning” (termed pATII). MiRNA profiles were obtained of both sATII and pATII using TaqMan® MicroRNA Arrays. MiRNAs with similar expression levels in sATII and pATII (|fold difference| < 1.5; termed ATII miRNAs) were used for Ingenuity® Pathway Analysis (IPA) with restriction to experimentally observed miRNA-mRNA interactions and canonical pathways. Isolated sATII showed a higher purity than pATII (98.4% vs. 72.6%) with a similar viability in sATII and pATII (96.2% vs. 96.7%). 111 miRNAs were expressed at similar levels in ATII cells obtained by the novel sorting method and the previously published method. In the Ingenuity® pathway enrichment analysis, nine pathways were associated with fibrosis and/or EMT and nine pathways were related to cancer within the top 20 signaling pathways. The transforming growth factor beta (TGF-beta) signaling pathway was identified as a key pathway regulated by 19 ATII miRNAs targeting 21 TGF-beta pathway components. This work contributes to the research field of ATII cells with three main findings. First, the newly developed isolation protocol can be used for future studies on primary murine ATII cells with the need for “untouched” cells with high purity and viability at the day of isolation. Second, for the first time a coherent ATII miRNA profile of healthy mice was obtained. Third, the identified ATII miRNAs seem to play an important role in the regulation of fibrosis/EMT, especially within the TGF-beta signaling pathway. Future studies investigating miRNAs in mouse models of lung diseases e.g. pulmonary fibrosis can compare their findings with the ATII miRNA profile of healthy mice of the present study and, thus, identify miRNA changes during pathogenesis of diseases.Alveolarepithel-Typ II (ATII) Zellen spielen eine wichtige Rolle in der Erhaltung der alveolaren Homöostase. Bei Verletzung, Verlust oder Dysregulation können ATII Zellen jedoch zu Lungenfibrose und malignen Erkrankungen durch epithelial-mesenchymale Transition (EMT) führen. Die komplexen Signalnetzwerke, die den physiologischen Zustand der ATII Zellen aufrechterhalten, sind bislang nur wenig verstanden. MicroRNAs (miRNAs) sind wichtige Regulatoren der Genexpression auf posttranskriptionaler Ebene. Das Ziel dieser Arbeit war die Identifikation von miRNAs, die von ATII Zellen unter physiologischen Bedingungen exprimiert werden, und die Ermittlung potentieller miRNA-regulierter Signalwege der ATII Zell-Homöostase. Ein neues Protokoll wurde für die Isolation von „unberührten“ murinen ATII Zellen mittels Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) basierend auf deren Autofluoreszenz entwickelt (bezeichnet als sATII). Die Reinheit und Viabilität der sATII wurden mit ATII Zellen, die durch die bereits publizierte Methode „Panning“ isoliert wurden (bezeichnet als pATII), verglichen. MiRNA Profile wurden von sATII und pATII mittels TaqMan® MicroRNA Arrays erstellt. Die ähnlich exprimierten miRNAs in sATII und pATII (|fold difference| < 1.5; bezeichnet als ATII miRNAs) wurden für Ingenuity® Signalweganalysen mit Beschränkung auf experimentell bestätigte miRNA-mRNA Interaktionen und kanonische Signalwege verwendet. Die isolierten sATII zeigten eine höhere Reinheit im Vergleich zu pATII (98.4% vs. 72.6%) bei ähnlicher Viabilität von sATII und pATII (96.2% vs. 96.7%). 111 miRNAs wiesen eine ähnliche Expression in ATII Zellen aus beiden Isolationsmethoden auf. In der Ingenuity® Signalweganalyse waren innerhalb der 20 häufigsten Signalwege neun mit Fibrose und/oder EMT und neun mit malignen Erkrankungen assoziiert. Der transforming growth factor beta (TGF-beta) Signalweg wurde mit 19 ATII miRNAs, die 21 TGF-beta Signalwegkomponenten regulieren, als ein zentraler Signalweg ermittelt. Die vorliegende Arbeit trägt drei wesentliche Erkenntnisse zu dem Forschungsgebiet der ATII Zellen bei. Erstens kann das neu etablierte Isolationsprotokoll für zukünftige Studien verwendet werden, die „unberührte“ murine ATII Zellen mit hoher Reinheit und Viabilität am Tag der Isolation benötigen. Zweitens wurde erstmalig ein umfassendes ATII miRNA Profil von gesunden Mäusen erstellt. Drittens scheinen die identifizierten ATII miRNAs eine wichtige Rolle in der Regulation von Fibrose/EMT, insbesondere im TGF-beta Signalweg, zu spielen. Zukünftige Studien, die ATII miRNAs in Mausmodellen von Lungenerkrankungen untersuchen, können diese mit dem Expressionsprofil gesunder Mäuse aus dieser Arbeit vergleichen und dadurch miRNA Veränderungen während der Pathogenese von Erkrankungen identifizieren