Role of beta-catenin in self-renewal and differentiation of mouse embryonic stem cells

Der kanonische Wnt-Signalübertragungsweg ist wichtig für die frühe embryonale Entwicklung und es gibt Hinweise, dass er auch für die Selbsterneuerungskapazität von Stammzellen benötig wird. Das essentielle intrazelluläre Molekül dieses Signalweges ist β-catenin, welches in Anwesenheit eines Wnt-Liganden stabilisiert und in den Kern transportiert wird, wo es dann mit TCF/LEF Tanskriptionsfaktoren interagiert und Zielgene anschaltet. Zusätzlich spielt β-catenin als Komponente der Adhäsionsverbindungen, in der Kalzium-abhängigen Zell-Zell Adhäsion eine Rolle. Diese Funktion von β-catenin während der Entwicklung ist bisher nicht gut charakterisiert. Mäuse in denen β-catenin deletiert wurde zeigen einen Entwicklungsarrest im Stadium der Bildung der Primitivrinne. Im umgekehrten Fall kommt es durch die Stabilisierung des β-catenin Proteins, d.h. Aktivierung des Signalweges, in der Mauszygote zu einem vorzeitigen Übergang vom epithelialen in den mesenchymalen Zustand im Epiblasten des eingenisteten Embryos. Diese Experimente geben jedoch keinen Aufschluss darüber, ob die phänotypischen Veränderungen durch die Funktion von β-catenin im Wnt-Signalweg oder in der Zelladhäsion bedingt sind. Um Einblick in dieses Problem zu gewinnen, habe ich ein zelluläres System basierend auf der embryonalen Mausstammzelle (mES) entwickelt. Dafür war es notwendig mES Zellen zu generieren, die kein funktionales β-catenin haben (β-catΔ/Δ). Diese Zellen wiesen keine Defekte in ihrer Selbsterneuer-ungskapazität auf, aber während der Differenzierung in sogenannte emryonen-ähnliche Strukturen zeigten sie einen Zelladhäsionsdefekt und gesteigerten Zelltod am Tag 5. Diese Unterschiede sind durch veränderte Proteinkonzentrationen von Plakoglobin bedingt, einem Molekül das dem β-catenin Protein sehr ähnlich ist. Zusätzlich zeigten Plakoglobin knock-down Experimente in β-catΔ/Δ ES Zellen dass die Zelladhäsion wahrscheinlich für die Erhaltung der Pluripotenz der ES Zellen wichtig ist. Um zwischen der Funktion von β-catenin im Wnt-Signalweg und der Zelladhäsion zu unterscheiden habe ich im zweiten Schritt β-catΔ/Δ ES Zellen generiert in denen β-catenin Isoformen exprimiert werden die für die Signal- nicht aber für die Zelladhäsionsfunktion defekt sind. Diese Zellen zeigen keinen Zelladhäsiondefekt oder Zelltod während der Differenzierung. Außerdem ergab eine Markeranalyse dieser differenzierten Zellen, dass die Zelladhäsionsfunktion von β-catenin für die Bildung der endodermalen Keimblattlinie benötigt wird. Zudem weisen diese Experimente darauf hin, dass diese Funktion von β-catenin für das Überleben der Zellen benötigt wird, dass sie aber nicht absolut essentiell für die terminale Differenzierung der neuroektodermalen Linie ist. Meine Studien haben außerdem gezeigt, dass der kanonische Wnt-Signalübertragungs-weg in ES Zellen unter Selbsterneuerungsbedingungen in Anwesenheit des Leukemia Inhibitorischen Faktors (LIF) nicht active ist, allerdings kann der aktivierte Wnt/β-catenin-Signalweg LIF-unabhängig die Pluripotenz der ES Zellen in einem gewissen Ausmaß aufrechterhalten. Zusammenfassend möchte ich festhalten, dass meine Arbeit zum ersten Mal die Notwendigkeit der β-catenin Zelladhäsionsfunktion für die Bildung der endodermalen und z.T der ektodermalen Keimblätter zeigt und zudem darauf hinweist, dass Zell-Zell Adhäsionsverbindungen für die Selbsterneuerungskapazität der Maus ES Zellen essentiell sind.The canonical Wnt signaling pathway is important during early embryogenesis and has been implicated in stem cell self-renewal. The essential intracellular mediator of this pathway is β-catenin, which is stabilized in the presence of a Wnt ligand and thus becoming translocated into the nucleus, where it interacts with TCF/LEF transcription factors to activate target gene expression. In addition, β-catenin, as a component of adherens junctions, is involved in calcium-dependent cell-cell adhesion. This role of β-catenin during development has not been well studied. Ablation of β-catenin in mouse leads to developmental arrest at the primitive streak stage of embryogenesis. Conversely, stabilization of β-catenin in the mouse zygote results in premature epithelial-mesenchymal transition in the epiblast of post-implantation embryo. However, these experiments did not address to what extent the phenotypic changes can be attributed to the signaling or cell-adhesion function of β-catenin. In order to gain insight into this problem, I established a mouse embryonic stem (mES) cell based system. This involved the derivation of ES cells deficient for β-catenin (β-catΔ/Δ). These cells showed no defects in self-renewal, but during embryoid body differentiation I noticed cell-adhesion defects and increased apoptosis around day 5. These differences occur because of alterations in plakoglobin levels, a molecule highly related to β-catenin. Moreover, plakoglobin knock-down experiments in β-catΔ/Δ ES cells suggest that cell-cell adhesion is most likely essential for proper maintenance of ES cell pluripotency. Secondly, in order to distinguish between adhesive and transcriptional functions of β-catenin, I re-expressed signaling-defective isoforms of β-catenin in β-catΔ/Δ ES cells. When these ES cell lines are differentiated in vitro, the adhesion defect and increased apoptosis observed during β-catΔ/Δ ES cell differentiation are rescued. Futhermore, marker analysis of differentiated EBs revealed that β-catenin cell-adhesion function is required for endoderm lineage formation. In addition, I found that β-catenin cell-adhesion function is essential for cellular survival, but not for formation and terminal differentiation of the neuroectoderm lineage. My studies also revealed that the canonical Wnt pathway is not active in self-renewing mES cells in the presence of leukemia inhibitory factor (LIF), but can sustain to some extent pluripotency in a LIF-independent manner when activated extrinsically. In conclusion, my findings show for the first time the importance of β-catenin cell-adhesion function in endoderm and ectoderm formation and suggest that cell-cell adhesion is essential for self-renewal of mES cells