Caractérisation de nouvelles protéines régulant et remodelant les flux lipidiques au cours du développement intracellulaire des parasites Apicomplexan

Apicomplexan parasites are responsible for major human infectious diseases such as malaria and toxoplasmosis against which there are no efficient vaccines and rapid emergence of drug resistance. The propagation and survival of these parasites depends on complex metabolic interactions with their human host cells. Lipid synthesis is one such key pathway crucial for parasite survival, which relies on an essential combination or ‘patchwork’ of fatty acids synthesized de novo and scavenged from the host. The molecular mechanism by which parasites combine and regulate the fatty acid flux from these two sources, remains unknown. My PhD project investigated pivotal role of two families of enzymes in parasite fatty acid metabolism: Acyl coA synthetases (ACS) and Phosphatidic acid phosphatases (LIPIN).Phosphatidic acid (PA), the simplest glycerophospholipid, acts as the rate limiting central lipid molecule in this process of fatty acid homeostasis. During my PhD, I investigated the role of a Toxoplasma phosphatidic acid phosphatase called TgLIPIN, in metabolising the critical levels of PA through controlled channelling of parasite vs host derived fatty acids. Toxoplasma tachyzoites are unable to survive a knockdown of LIPIN due to severe replication defect amongst several other membrane anomalies. This cytosolic enzyme catalyses the synthesis of diacylglycerol from phosphatidic acid, a central lipid precursor and signal transducer, as confirmed by heterologous complementation and lipidomics approaches. The disruption of TgLIPIN induces loss of parasite lipid storage concomitantly with an increase of the total lipid content (fatty acids), leading to rapid parasite death by ‘lipotoxicity’. With the help of 13C glucose-based fluxometrics using GC-MS, we identified that the source of these toxic fatty acids (FA) is the host (esp C18:1) whilst the FASII activity of the parasite is reduced. Electron microscopy reveals that TgLIPIN indirectly regulates nuclear membrane morphology and also the inner membrane complex biogenesis, suggesting the importance of lipid balance during the growth of parasite. Overall, we suggest that TgLIPIN protects parasite against FA-induced toxicity allowing a normal replication cycle within its host by regulating the critical levels of phosphatidic acid.The second project during my PhD focused on the enzymatic pathway involved in the activation of fatty acids within these parasites. In eukaryotes, the activation of fatty acids to their acyl-coA thioesters is a two-step energy requiring biochemical process that involves key enzymes called Acyl-coA synthetases (ACS). Since, fatty acids are virtually involved all aspects of cellular biochemistry, their activation pathway could be an Achilles heel for the parasite survival within its host. In an attempt to the same, we have identified a novel family of 7 enzymes in Toxoplasma gondii as putative acyl-coA synthases (TgACSs). All the putative TgACSs, tagged endogenously, localize to non-overlapping sub-cellular compartments of the parasite. Using parasite genetics approaches and GC-MS based lipidomics, TgACS3 was functionally characterised. Genetic ablation of TgACS3 affected parasite replication within its host. TgACS3 depletion reduced the overall fatty acid content within the parasite phospholipids alongside a significant increase in the amount of free fatty acids, further confirming its function as an ACS.Les parasites Apicomplexan sont responsables de grandes maladies infectieuses chez l'homme, telles que le paludisme et la toxoplasmose, contre lesquelles il n'existe pas de vaccins efficaces et une émergence rapide de la résistance aux médicaments. La propagation et la survie de ces parasites dépendent d'interactions métaboliques complexes avec leurs cellules hôtes humaines. La synthèse des lipides est l’une de ces voies cruciales pour la survie des parasites, qui repose sur une combinaison essentielle ou un «patchwork» d’acides gras synthétisés de novo et récupérés de l’hôte. Le mécanisme moléculaire par lequel les parasites combinent et régulent le flux d'acides gras de ces deux sources reste inconnu. Mon projet de thèse portait sur le rôle essentiel de deux familles d'enzymes dans le métabolisme des acides gras du parasite: Acyl coA synthetases (ACS) et Phosphatidic acid phosphatases (LIPIN).L'acide phosphatidique (PA), le glycérophospholipide le plus simple, joue le rôle de molécule lipidique centrale limitante dans ce processus d'homéostasie des acides gras. Au cours de ma thèse, j'ai étudié le rôle de la TgLIPIN, une phosphatase acide toxoplasmique phosphatidique, dans la métabolisation des niveaux critiques d'AP par le biais de la canalisation contrôlée des acides gras dérivés des acides gras. Les tachyzoïtes de Toxoplasma sont incapables de survivre à l’effondrement de LIPIN en raison d’un défaut de réplication grave parmi plusieurs autres anomalies de la membrane. Cette enzyme cytosolique catalyse la synthèse de diacylglycérol à partir d'acide phosphatidique, précurseur lipidique central et transducteur de signal, comme le confirment les approches de complémentation hétérologue et de lipidomique. La perturbation de la TgLIPIN induit une perte de stockage des lipides du parasite, associée à une augmentation de la teneur en lipides totaux (acides gras), conduisant à une mort rapide du parasite par «lipotoxicité». À l'aide de la fluxométrie 13C à base de glucose et de la GC-MS, nous avons identifié que la source de ces acides gras toxiques (FA) est l'hôte (en particulier C18: 1), tandis que l'activité de FASII du parasite est réduite. La microscopie électronique révèle que TgLIPIN régule indirectement la morphologie de la membrane nucléaire ainsi que la biogenèse du complexe de la membrane interne, ce qui suggère l’importance de l’équilibre lipidique lors de la croissance du parasite. Globalement, nous suggérons que TgLIPIN protège le parasite contre la toxicité induite par l'AF, permettant ainsi un cycle de réplication normal chez son hôte en régulant les niveaux critiques d'acide phosphatidique.Le deuxième projet de ma thèse portait sur la voie enzymatique impliquée dans l'activation des acides gras au sein de ces parasites. Chez les eucaryotes, l'activation des acides gras en leurs acyl-coA thioesters est un processus biochimique nécessitant une énergie en deux étapes qui implique des enzymes clés appelées Acyl-coA synthetases (ACS). Étant donné que les acides gras sont pratiquement impliqués dans tous les aspects de la biochimie cellulaire, leur voie d'activation pourrait être un talon d'Achille pour la survie du parasite chez son hôte. Dans le même esprit, nous avons identifié une nouvelle famille de 7 enzymes dans Toxoplasma gondii, les acyl-coA synthases (TgACS) putatives. Tous les TgACS présumés, marqués de manière endogène, se localisent dans des compartiments sous-cellulaires du parasite qui ne se chevauchent pas. En utilisant des approches de génétique parasitaire et une lipidomique à base de GC-MS, TgACS3 a été caractérisé fonctionnellement. L'ablation génétique de TgACS3 a affecté la réplication du parasite chez son hôte. L’appauvrissement en TgACS3 a réduit la teneur globale en acides gras des phospholipides du parasite, parallèlement à une augmentation significative de la quantité d’acides gras libres, confirmant ainsi sa fonction d’AC