Membrane biogenesis in Apicomplexa parasites : How trafficking and recycling lipid sources for dynamic membrane remodeling sustain parasite survival within its human host

Les parasites apicomplexes sont responsables de graves maladies telles que le paludisme tuant encore presque un demi-million de personnes par an, ou la toxoplasmose dont près d’un tier de la population mondiale est chroniquement infecté. Ces infections touchent à la fois les humains et les élevages et ont de forts impacts sociaux et économiques, plus important encore dans les pays en développement. Ces maladies sont causées par des parasites unicellulaires et obligatoirement intracellulaires, dont la prolifération dépend de l’acquisition massive de lipides par deux mécanismes : détournement des ressources lipidiques de l’hôte et synthèse de novo. Ces parasites utilisent ces deux sources pour former un « patchwork » essentiel à leur développement. Alors que la synthèse d’acides gras et de phospholipides ont été largement étudiés, le transport de ces lipides reste méconnu. Quels transporteurs sont impliqués dans le trafic de lipides dans le parasite et entre ses différent organelles ? Pour répondre à cette question, j’ai étudié et caractérisé durant ma thèse différents transporteurs de lipides de la famille des P-type ATPases, une P5 ATPase, FLP12, sous-groupe dont l’affinité de substrat reste mal connu et une P4-ATPase, FLP2, prédite pour « flipper» des phospholipides dans les membranes lipidiques.La plupart des Apicomplexes possèdent une organelle dérivée d’un chloroplaste, nommé l’apicoplaste, capable de synthétiser des acides gras courts grâce à sa voie procaryote de synthèse des acides gras (FASII). Ces acides gras sont, soit, exportés hors de l’apicoplaste, soit utilisés pour former de l’acide lyso- ou phosphatidique, précurseur membranaire central. Le processus par lequel ces différents lipides sont exportés hors de l’apicoplaste reste inconnu. Au cours de ma thèse, j’ai étudié le rôle d’une P5-ATPase chez Toxoplasma, TgFLP12, localisé dans les membranes de l’apicoplaste. L’analyse phylogénétique de TgFLP12 révèle qu’elle appartient à un nouveau sous-groupe de P5-ATPase, P5C. L’arrêt de l’expression de TgFLP12 est létal pour le parasite et ralentit sa réplication intracellulaire. L’analyse du lipidome par GC-MS combinées à des marquages métaboliques montre que TgFLP12 est essentiel pour l’incorporation d’acide myristique issue de la FASII dans les différentes classes de lipides. Seule la complémentation exogène par des acides gras similaires à ceux produits par la FASII restore la croissance parasitaire. Les résultats de ces différentes approches, ainsi que la présence de l’homologue de FLP12 chez tous les Apicomplexes portant un apicoplaste, pointent TgFLP12 comme étant l’exporteur d’acide gras de l’apicoplaste en l’absence du transporteur canonique du chloroplaste présent chez les organismes photosynthétiques.La seconde partie de mon projet de thèse a porté sur la caractérisation d’une P4-ATPase, TgFLP2, présent dans le Golgi du parasite et qui est essentiel à sa survie. Les P4-ATPases sont impliquées dans le maintien de l'asymétrie membranaire permettant la courbure membranaire nécessaire au trafic vésiculaire. Chez Toxoplasma, j’ai montré que TgFLP2 joue un rôle essentiel dans le contrôle du trafic vésiculaire issu du réseau trans-Golgi. Sa délétion est néfaste au trafic du contenu des micronèmes, organelles de sécrétion essentiels pour l’invasion et la sortie active du parasite de son hôte. TgFLP2 joue un rôle central dans les processus nouvellement découverts d’endocytose parasitaire, permettant l’acquisition de nutriments issus de l’hôte. TgFLP2 est essentielle pour l’homéostasie lipidique du parasites et sa suppression entraine une rapide baisse dans sa composition en phosphatidyléthanolamine (PE). Ce phénotype est similaire à celui observé lors de l’inactivation de ses homologues chez la levure, Neo1p et Drs2p, deux P4 également localisées dans le Golgi. Tous ces éléments pointent le rôle central de TgFLP2 dans le contrôle du trafic vésiculaire trans-Golgi du parasite et illustre son importance pour sa survie.Apicomplexan parasites are responsible for severe diseases such as malaria, which kills almost half a million people yearly, and toxoplasmosis, which chronically infects nearly one-third of the population worldwide. These infections affect humans and livestock and have serious social and economic impacts, which are more important in developing countries. These diseases are caused by unicellular and obligate intracellular parasites, whose proliferation depends on the acquisition of lipids through the massive scavenging from their hosts and their own de novo synthesis capabilities. These parasites use these two sources to form a lipidic "patchwork" essential for their development. While the synthesis of fatty acids or phospholipids is widely studied, little is known about the transport of those lipids. Which transporters are involved in the lipidic transport within the parasite and between these different intracellular compartments? To answer this question, I focused my interest and PhD project on major Apicomplexa lipid transporters of the P-type ATPase family: a P5 ATPase, FLP12, which subgroup’s substrate affinity remains poorly known, and a P4 ATPase, FLP2, predicted to "flip" phospholipids.Most Apicomplexan parasites have a relic plant-like plastid called the apicoplast, a non-photosynthetic organelle capable of synthesizing short fatty acids via its prokaryotic fatty acid synthesis pathway (FASII). These fatty acids are either exported out of the apicoplast or directly used to form lyso- or phosphatidic acid for parasite membrane biogenesis. How these different lipids are exported outside the apicoplast remains unknown. During my thesis, I identified and characterized a novel P5-ATPase in Toxoplasma, TgFLP12, which localizes in the apicoplast membranes. Phylogenetic analysis of TgFLP12 reveals that it belongs to a new subgroup of P5-ATPase, P5C. The shutdown of TgFLP12 expression is lethal to the parasite by slowing down its intracellular replication. Analysis of the lipidome and lipid fluxes by GC-MS and combined with isotopic metabolic markers shows that TgFLP12 is essential for the incorporation of myristic acid from the FASII in the different classes of lipids used for membrane biogenesis. In its absence, the parasites lose most fatty acids derived from FASII. Only the complementation by short fatty acids similar to those made by the FASII can restore the growth of the parasites. The data obtained by these different approaches, and the presence of its homolog in most Apicomplexa bearing an apicoplast, all point to TgFLP12 being the apicoplast fatty exporter likely replacing the canonical chloroplast fatty acid exporter usually found in photosynthetic organisms.The second part of my project focused on the characterization of a P4 ATPase, named TgFLP2, present in the trans-Golgi network of the parasite, and essential for its survival. P4-ATPases are known to be involved in the maintenance of membrane asymmetry allowing membrane curvatures necessary for vesicular trafficking. I reveal that in Toxoplasma, TgFLP2 plays an essential role in most of the known trans-Golgi vesicular trafficking. Its deletion is notably critical for the import of the content of micronemes, secretory organelles essential for the active invasion and egress of the parasite from the host. Furthermore, we show that TgFLP2 also plays a central role in the newly discovered endocytosis machinery of the parasite, allowing the trafficking of vesicles essential for the completion of endocytosis. TgFLP2 is also essential for the lipid homeostasis of the parasite and its deletion leads to a rapid decrease of its phosphatidylethanolamine (PE) composition, a similar phenotype observed in its yeast counterparts, Neo1p and Drs2p, two P4 also present in the yeast Golgi. All these elements show the central role of TgFLP2 in the control of trans-Golgi vesicular trafficking and illustrate its central role to regulate parasite intracellular trafficking