ETUDES STRUCTURALES, CELLULAIRES ET PHARMACOLOGIQUES DE LA SYNTHESE DES GALACTOLIPIDES CHEZ ARABIDOPSIS THALIANA ET TOXOPLASMA GONDII

I will paste one soon...Les galactoglycérolipides (i.e. monogalactosyldiacylglycérol, MGDG et digalactosyldiacylglycérol, DGDG) sont les lipides majeurs des membranes des chloroplastes, représentant jusqu'à 80% de la composition membranaire plastidiale. La synthèse de ces galactolipides est catalysée par deux types de galactosyltransférases, les MGDG synthases (ou MGD) et les DGDG synthases (ou DGD). Lors de cette synthèse, un groupement ß-galactosyl provenant d'un UDP- aGal, est transféré sur la position sn-3 d'un diacylglycérol (DAG). Les DGD utilisent le MGDG produit par les MGD comme substrat pour la synthèse du DGDG. La synthèse du MGDG est donc essentielle pour la biogenèse du chloroplaste et par conséquent pour la survie de la cellule végétale. Les Apicomplexes sont des parasites intracellulaires obligatoires d'importance médicale et vétérinaire. Ils possèdent un plaste vestigial non-photosynthétique, nommé apicoplaste, acquis par endosymbiose secondaire d'une algue rouge. L'apicoplaste est impliqué dans de nombreuses voies métaboliques de type végétal. De plus, il est essentiel à la survie du parasite. La synthèse de galactolipides aux propriétés chromatographiques indiscernables de celles du MGDG et du DGDG a été mesurée chez Toxoplasma gondii, le parasite Apicomplexe responsable de la toxoplasmose. Nous avons entrepris une étude comparative du métabolisme et de la dynamique des galactolipides chez les plantes et des lipides structurellement apparenté chez les parasites Apicomplexes, par des analyses de biochimie, biologie structurale, moléculaire et cellulaire chez A. thaliana et T. gondii. Nous avons tout d'abord établi un modèle structural de la MGDG synthase chloroplastique basée sur son homologie avec la glycosyltransférase bactérienne MURG. Ce modèle structural a été validé par mutations ponctuelles rationalisées. Ce modèle indique les résidus impliqués dans la liaison de l'UDP-Gal et permet d'avancer dans notre compréhension du mécanisme catalytique. Il permet de proposer certaines régions comme participant à la fixation du DAG et à l'association à la membrane du chloroplaste. La structure présentée dans ce manuscrit constitue un outil pour l'étude d'inhibiteurs de la MGDG synthase et la compréhension de l'évolution complexe des enzymes de galactosylation. Nous avons montré que des inhibiteurs des MGDG synthases de plantes, identifiés par criblage pharmacologique d'une chimiothèque de 23360 composés, avaient des propriétés herbicides, algicides et anti-parasitaire sur A. thaliana, C. reinhartdii et T. gondii respectivement. Nous avons par la suite engagé un programme d'optimisation par synthèse chimique et mesuré les effets de plus de 200 dérivés des molécules initiales. Cette stratégie nous a permis d'optimiser certaines de ces molécules dans l'objectif de développer des candidats herbicides/médicaments. Grâce à l'utilisation de serums de lapin et de rat obtenus après immunisation avec du DGDG, nous avons détecté chez T. gondii un lipide, désigné DGLE (digalactolipid-like epitope), structuralement apparenté au digalactolipide. Ce lipide est localisé au niveau des membranes de la pellicule du parasite. De plus, la localisation du DGLE dépend du stade de vie du parasite, redistribué lors de l'invasion dans une cellule hôte. Le DGLE semble lié aux protéines associées au cytosquelette d'actine et/ou à des domaines membranaires. La détermination du lipidome de la pellicule par spectrométrie de masse montre que des dihexosyl-lipides mineurs dérivés de diacylglycérol, alkyl-acyl ou de céramide ont une masse compatible avec le DGLE. La question de la structure du DGLE, pour sa partie hydrophobe, reste donc irrésolue. Ce lipide a été détecté chez d'autres Apicomplexes tels que Plasmodium falciparum (agent de la malaria) et Cryptosporidium parvum (agent de la cryptosporidiose). Le fait d'avoir pu induire une réponse immunitaire par injection du DGDG chez le lapin et le rat conduisant à la détection d'un épitope à la surface de T. gondii, nous a amené à étudier l'antigène digalactolipidique et ses applications éventuelles dans des visées diagnostiques et / ou thérapeutiques. Nous avons montré que le serum provoquait l'agglutination du parasite et empêchait son invasion dans la cellule hôte in vitro. Le marquage de la surface du parasite par le serum (i.e. l'opsonisation) active la réponse immunitaire inné in vitro. La phagocytose par les macrophages et l'activation du complément est accrue par rapport au contrôle. Ces résultats préliminaires suggèrent que des outils diagnostics et/ou des stratégies vaccinales nouveaux, basés sur la reconnaissance de l'antigène digalactolipidique de surface des parasites Apicomplexes, pourraient être envisagés. Les perspectives de ces travaux incluent une poursuite du développement des inhibiteurs des MGDG synthases pour d'une part des recherches fondamentales par des approches de génétique chimique (invalidation chimique, utilisation de dérivés couplés à la biotine), et d'autre part des applications éventuelles en tant que candidat herbicides et / ou antiparasitaires. L'étude du rôle et de la synthèse des galactolipides chez T. gondii nécessitera la résolution de la structure du DGLE et la recherche des enzymes impliquées dans sa synthèse. Les effets remarquables du serum anti- DGDG mesuré in vitro devront être approfondis sur modèle animal