Efeito do modelador epigenético 5-Aza-2’-Deoxycytidine no desenvolvimento dos embriões bovinos produzidos após choque térmico em oócitos

Climate changes is a threat to the species and the financial sustainability of the production systems. Preliminary studies showed that bovine embryos submitted to heat shock presented differentiated levels of heterochromatin, which can compromise the development. Some substances interfere in the chromatin structure or DNA methylation can influence the epigenetic events of embryonic development. The objective of this work was to evaluate the effect of 5-aza-2'deoxycytidine in the production of bovine embryos using oocytes submitted to heat shock. Oocytes of slaughterhouse cows were matured in TCM-199 + 10% serum cow in heat and distributed on: experiment 1 (NHS without heat shock) - 5%CO2 and 38.5ºC 24h; experiment 2 (HS with heat shock) - 6.5-7.0%CO2 and 41.5ºC 12h + 12h in 5%CO2 and 38.5ºC. IVF was performed in FERT-TALP for 20h in conventional maturation conditions. The cultivation was performed in CR2aa+2.5%FBS a 38.5ºC, 5%CO2 and 5%O2 for 8 days. In each experiment, the embryos were divided into the following treatments: without addition of 5-aza (NHS or HS - Controls), exposed to 5- aza(10nm) for 24h (or NHS24h or HS24h) or 48h (or NHS48h or HS48h). After exposure to the drug, embryos were cultivated in the same NHS and HS to complete development. The development stage and the rate of embryos were evaluated at day 3 (D3), 7 (D7) and 8 (D8), and blastocysts were evaluated by TUNEL as the apoptotic rate. Embryos D2 and D3 were submitted to immunofluorescence for marking HP1β. There was no difference in the cleavage of the two experiments. The percentage of 8-cell embryos D3 was lower in all the groups treated with 5-aza. Lower blastocyst rates were obtained in treatment NHS48h. Lower blastocysts rates were produced in D7 and D8 to HS24h and HS48h.The number of total cells and the inner cell mass of blastocysts was similar between groups in the two experiments. The apoptotic index in experimental group 1 was similar, and in experiment 2 occurred only difference between HS24h and HS48h groups. The apoptotic index of the inner cell mass did not differ in both experiments. The use of 5-aza do not affect the cleavage rates in D3, but the long exposition reduces blastocyst rates. Associated with heat shock, 5-aza reduces blastocyst rates independent of the exposition time. However, there was no detectable cell injury in embryos that developed to blastocyst. The intensity of the signal for heterochromatin in embryos with 4-7 cells was similar between the groups, the percentage of HP1β negative nucleus was low and more nucleus were exhibiting increased HP1β signal in NHS24h. 8-16 cell embryos present a reduction of signal intensity when exposed to 5-aza, which does not occur in the heat shock embryos with similar intensities to NHS, and 5-aza has apparently no effect on HP1β levels. Changes in euchromatin and heterochromatin patterns in the heat shock embryos may be related to a complex EGA related to those groups, which might be related to lower blastocyst rate.As mudanças climáticas constituem ameaça às espécies e à sustentabilidade financeira dos sistemas de produção. Estudos preliminares mostraram que embriões bovinos submetidos ao choque térmico apresentam níveis diferenciados de heterocromatina, o que pode comprometer o desenvolvimento. Algumas substâncias interferem na estrutura da cromatina ou na metilação do DNA e podem influenciar os eventos epigenéticos do desenvolvimento embrionário. O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito de 5-aza-2’-deoxycytidine na produção de embriões bovinos utilizando oócitos submetidos ao choque térmico. Oócitos de vacas de abatedouro foram maturados em TCM-199+10% soro de vaca em cio e distribuídos em: experimento 1(NHS, sem choque térmico) - 5%CO2 e 38,5ºC 24h; experimento 2 (HS, choque térmico) - 6,5-7,0%CO2 e 41,5ºC 12h + 12h em 5%CO2 e 38,5ºC. Foi realizada FIV em FERT-TALP por 20h nas condições convencionais de maturação. Procedeu-se o cultivo em CR2aa+2,5%SFB a 38,5ºC, 5%CO2 e 5%O2 por 8 dias. Em cada experimento os embriões foram divididos nos seguintes tratamentos: sem adição de 5-aza (NHS ou HS - Controles), expostos a 5-aza (10nM) por 24h (NHS24h ou HS24h) ou por 48h (NHS48h ou HS48h). Após exposição à droga os embriões foram cultivados em meio idêntico ao de NHS e HS até completarem o desenvolvimento. O estágio de desenvolvimento e a taxa de embriões foram avaliados nos dias 3 (D3), 7 (D7) e 8 (D8), e blastocistos D8 foram avaliados por TUNEL quanto à taxa apoptótica. Embriões D2 e D3 foram submetidos à imunofluorescência para marcação de HP1β. Não houve diferença na clivagem dos dois experimentos. O percentual de embriões com 8 células em D3 foi menor em todos os grupos tratados com 5-aza. Menores taxas de blastocistos em D7 e D8 foram obtidas no tratamento NHS48h. Menores taxas de blastocistos foram produzidas em D7 e D8 para HS24h e HS48h. O número de células totais e da massa celular interna dos blastocistos não diferiu entre os grupos dos dois experimentos. O índice apoptótico nos grupos do experimento 1 foi similar, e no experimento 2 ocorreu diferença apenas entre os grupos HS24h e HS48h. O índice apoptótico da massa celular interna não diferiu nos dois experimentos. O uso de 5- aza não influencia as taxas de clivagem em D3, mas a longa exposição reduz as taxas de blastocistos. Associado ao choque térmico, 5-aza reduz as taxas de blastocistos independente do tempo de exposição. No entanto, não houve injúrias celulares detectáveis nos embriões que se desenvolveram a blastocisto. A intensidade do sinal para heterocromatina em embriões com 4-7 células foi similar entre os grupos, o percentual de núcleos não marcados foi baixo e NHS24h marcou mais núcleos fortemente. Embriões de 8-16 células apresentaram redução na intensidade do sinal quando expostos a 5-aza, o que não ocorre nos embriões de choque térmico, com intensidades similares a NHS, e 5-aza não tem aparente efeito sobre a presença de HP1β. Mudanças nos padrões de eucromatina e heterocromatina nos embriões de choque térmico podem estar relacionadas a uma ativação do genoma embrionário mais complexa, reduzindo a produção de blastocistos.FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerai