Sinteza spojin za afinitetno kromatografijo za študije makromolekulskih tarč

Heart failure is a global public health problem that affects millions of people worldwide. Currently available medical therapy provides only a temporary improvement of the symptoms, yet does not stop the progression of the disease. Consequently, there is an unmet need in the development of new therapies to stop progression or even reverse this pathological state. Lately, cardiac transcription factors have been extensively investigated, since they have an essential role in both physiological and pathological processes, including myocardial hypertrophy. Two such transcription factors are GATA4 and NKX2-5, both having a pivotal role in heart development as well as in cardiac hypertrophy. We synthesized a series of compounds for affinity chromatography, based on a potent inhibitor of GATA4-NKX2-5 transcriptional synergy. Designed derivatives have tri- and pentaethylene glycol linker attached at different positions. In later work, two final compounds were assayed for binding affinity with GATA4 and NKX2-5, in order to study the effect of linker position on the ligand-protein affinity. Additionally, control compound was synthesised to study the non-specific binding of used proteins to compounds, linkers, and matrix. The results of the biological assay on GATA4 confirmed that control compound does not bind GATA4, yet there was a presence of some non-specific protein binding. Additionally, it has been observed that linker position does not alter compound-protein binding affinity. On the other hand, binding of NKX2-5 has proved to be non-specific. The described synthesis can be of great help in the synthesis of similar affinity chromatography compounds. Combined with the results of the biological testing, the synthesized compounds are a good basis for further optimization and research in the area.Srčno popuščanje je kompleksni klinični sindrom in globalni zdravstveni problem, ki prizadene več kot 23 milijonov ljudi po svetu. Razvije se lahko iz številnih bolezni srca in ožilja, med katerimi sta najpogostejša vzroka srčni infarkt in hipertenzija. Trenutno uporabljena zdravila za zdravljenje srčnega popuščanja sicer izboljšajo prognozo bolezni, vendar pa ne ustavijo napredovanja bolezni, zato obstaja velika potreba po razvoju novih, učinkovitejših zdravil. Kot potencialne tarče pri zdravljenju srčnega popuščanja se raziskujejo tudi transkripcijski faktorji. Ti kontrolirajo izražanje genov, ki nosijo zapis za strukturne in regulatorne proteine kardiomiocitov. Poleg fizioloških pa imajo pomembno vlogo tudi v patoloških procesih, med drugim pri nastanku in napredovanju srčne hipertrofije pri srčnem popuščanju. Hipertrofija je eden izmed kompenzatornih mehanizmov, ki sprva sicer izboljša kontraktilnost srčne mišice in s tem srčni iztis, vendar pa njeno napredovanje v končni fazi vodi do poslabšanja klinične slike. Hipertrofijo lahko obravnavamo kot motnjo v regulaciji genov, saj različni hipertrofični dejavniki preko številnih signalnih poti na koncu vodijo do sprememb v aktivnosti transkripcijskih faktorjev in posledično izražanju genov. Dva izmed transkripcijskih faktorjev, udeleženih v procesu hipertrofije sta GATA4 in NKX2-5, ki imata pomembno vlogo pri razvoju srca in uravnavanju njegove funkcije. Tekom neonatalnega razvoja GATA4 spodbuja kardiogenezo in diferenciacijo nekardiogenih v kardiogene celice. V odraslem srcu uravnava hormonski odziv na mehanski stres, zadnje raziskave pa mu pripisujejo tudi vlogo pri regeneraciji srčne mišice po poškodbi. Podobno vlogo pri razvoju srca ima tudi NKX2-5, ki dodatno deluje kot GATA4 kofaktor in potencira njegovo delovanje. Oba pa sta udeležena tudi v procesu razvoja srčne hipertrofije. Raziskave so namreč pokazale, da je povečano izražanje genov za GATA4 zadostno za iniciacijo hipertrofije v celičnih kulturah in miših, ter povečano število angiotenzinskih receptorjev tipa 1a. Dodatno je bilo opaženo tudi povečano izražanje genov za GATA4 in NKX2-5 v volumsko in z agonistom induciranih hipertrofičnih modelih srca. Ker transkripcijski faktorji nimajo encimske aktivnosti, so zelo redko obravnavani kot potencialne tarče pri zdravljenju. Je pa možno vplivati na njihovo aktivnost preko vpliva na njihovo vezavo z DNK ali kofaktorji. Na Univerzi v Helsinkih so na podlagi analiz in silico in luciferaznega testa odkrili več spojin, ki bodisi okrepijo ali zavirajo GATA4-NKX2-5 transkripcijsko sinergijo, pri čemer pa ne vplivajo na njuno vezavo z DNK. V hipertrofičnih modelih in vitro je najmočnejši izmed zaviralcev 3i-1000 (IC50=3μM) učinkovito preprečil hipertrofijo miokarda. Poleg zmanjšanega izražanja genov za natriuretične peptide, ki se navadno povečano izločajo ob mehanskem nategu kardiomiocitov, je bilo opaženo tudi zmanjšano posttranslacijsko fosforiliranje GATA4. V eksperimentalnih modelih srčnega infarkta in vivo pri miših je zdravljenje z 3i-1000 štiri dni po povzročenem infarktu statistično pomembno izboljšalo srčni iztis in preprečilo strukturne spremembe srca, kot sta dilatacija levega ventrikla in hipertrofija. Prav tako je bilo zmanjšano izražanje genov za natriuretične peptide. Te ugotovitve kažejo, da bi ta spojina lahko predstavljala pomemben korak pri zdravljenju oziroma preprečevanju srčnega popuščanja. V okviru magistrske naloge smo na podlagi dosedanjih spoznanj načrtovali spojine za afinitetno kromatografijo, z namenom določiti afiniteto teh spojin do GATA4 in NKX2-5, ter hkrati določiti vpliv dolžine in položaja distančnika na afiniteto spojin do omenjenih proteinov. Sintetizirane spojine so derivati spojine 3i-1000, zaviralca GATA4-NKX2-5 interakcije, ki imajo pripret polietilen glikolni distančnik. To omogoča imobilizacijo spojine na stacionarno fazo in njeno uporabo v afinitetni kromatografiji. Končne spojine imajo različno dolg distančnik, in sicer tri- in pentaetilen glikol (PEG3 in PEG5), pripet na različna mesta v molekuli. Dodatno smo sintetizirali tudi kontrolno spojino. Gre za biološko neaktivni strukturni analog spojine 3i-1000, ki smo ga v afinitetni kromatografiji uporabili za določevanje nespecifične vezave GATA4 in NKX2-5 na distančnik in stacionarno fazo, kar bi lahko bil vzrok za lažno pozitivne rezultate. Sintezo smo uspešno izvedli z uporabo komercialno dostopnih reagentov, pri čemer je bilo potrebno postopke pogosto optimizirati. Pripenjanje PEG3 distančnika smo izvedli z uporabo aminotrietilenglikol bromida z boc zaščitno skupino. Ker so amidi in sekundarni para-nitro substituirani aromatski amini, preko katerih smo distančnik pripeli na spojino, šibki nukleofili, je bila potrebna uporaba močne baze za dosego zadostnega deprotoniranja in zato povečanja nukleofilnosti. V končni stopnji sinteze smo s kislo hidrolizo odstranili boc zaščitno skupino. Podoben pristop smo želeli uporabiti tudi pri sintezi spojin s PEG5 distančnikom, vendar pa se je uporaba boc zaščitenih etilen glikolov v tem primeru izkazala za neustrezno. Kot ustrezna alternativa se je z visokimi izkoristki reakcij izkazal bromopentaetilenglikolazid. Končna stopnja v sintezi je potekala po mehanizmu Staudingerjeve reakcije, ki je blaga in učinkovita redukcija azidov v amine. Dve izmed sintetiziranih spojin sta bili nadalje imobilizirani na stacionarno fazo in uporabljeni v bioloških testiranjih. Z metodo afinitetne kromatografije smo dvema pozicijskima analogoma določili vezavo na GATA4 in NKX2-5 z namenom določiti vpliv položaja distančnika na afiniteto. Hkrati pa smo s kontrolno spojino preverjali tudi nespecifično vezavo uporabljenih proteinov na spojine, distančnik in stacionarno fazo. Rezultati so pokazali, da GATA4 v primerjavi z NKX2-5 izkazuje bistveno manjši obseg nespecifične vezave. Na nitrocelulozni membrani je sicer prisotna skoraj zanemarljiva lisa, kar pa lahko glede na dejstvo, da je kontrolna spojina biološko neaktivna, pripisujemo nespecifični vezavi GATA4 na matriks ali distančnik. Po drugi strani pa se je vezava NKX2-5 na sintetizirane spojine izkazala za nespecifično, saj se NKX2-5 enako močno veže tako na kontrolno kot tudi na biološko aktivne spojine. V skladu s pričakovanji so rezultati pokazali, da položaj distančnika bistveno ne vpliva na moč vezave. Predhodne analize razmerja med strukturo in delovanjem so namreč pokazale, da so glavne strukturne komponente za vezavo 3i-1000 na GATA4 dva aromatska obroča, povezana z relativno rigidnim mostom in akceptor vodikove vezi zraven petčlenskega aromatskega obroča. To nakazuje, da amidni proton in sekundarni amin ne igrata bistvene vloge pri vezavi 3i-1000 na GATA4. Dodatno se je izkazalo, da je opisan postopek afinitetne kromatografije uporabna metoda za izolacijo GATA4. GATA4 je dokaj nestabilen protein, ki hitro razpade, zato je njegova izolacija v nativni obliki pogosto težavna. V našem primeru pa smo uspeli izolirati celoten protein, brez kakršnekoli razgradnje. Opisane in optimizirane posamezne stopnje sinteze bodo lahko v pomoč pri sintezi podobnih spojin za uporabo v afinitetni kromatografiji. Skupaj z rezultati bioloških testiranj, sintetizirane spojine predstavljajo dobro osnovo za nadaljnje raziskave na področju izolacije in identifikacije GATA4 in NKX2-5 transkripcijskih faktorjev