Design and synthesis of O-GlcNAc transferase inhibitors with quinolinone-6-sulfonamide scaffold

O-vezana β-N-acetilglukozamin transferaza (OGT) je znotrajcelični encim, čigar vloga v telesu in vloga v patologiji raznih bolezni se zadnjih 20 let intenzivno raziskuje. Študije so pokazale, da so reakcije glikozilacije proteinov, ki jih ta encim katalizira, izredno pomembne pri uravnavanju celičnega cikla, izražanju genov, celičnem odzivu na stres, znotrajcelični signalizaciji in mnogih drugih procesih, ki v celici potekajo. Hkrati so prek tega encima vsi omenjeni procesi povezani s presnovnim stanjem celice, saj je količina uridin difosfat Nacetilglukozamina (UDP-GlcNAc) odvisna od količine glukoze, ki je celici trenutno na voljo. Odkrili so, da je v celicah diabetičnih bolnikov in celicah določenih vrst tumorjev (rak prostate, rak dojk), močno povečano število glikoziliranih produktov te reakcije. Vemo, da rakave celice povečajo vnos hranil, da bi lahko zadostile svojim metabolnim potrebam. Prav tako je pri sladkorni bolezni tipa 2 povečan vnos glukoze v številne celice, kljub rezistenci na inzulin, zaradi konstitutivno prisotnih transporterjev. Ta metabolna iztirjenost vodi v pospešitev pripenjanja N-acetilglukozamina na serinske in treoninske ostanke tarčnih proteinov, kar pri rakavih celicah vpliva na spremembo celičnega cikla, invazivnost, tvorbo novih krvnih žil in zmožnost metastaziranja, v celicah prediabetikov pa pripomore k razvoju inzulinske rezistence. Preden se lahko posvetimo oblikovanju celovitih terapevtskih pristopov pri obravnavi teh bolezni, je potrebno nadaljnje raziskovanje in širjenje znanja o vlogah OGT v organizmu. Zaviralci tega encima so močno orodje, ki nam preko zaviranja njegovega delovanja v različnih celičnih kulturah omogoča raziskovanje njegovega vpliva na razne celične funkcije. Dober zaviralec mora selektivno in močno zavirati dani encim, hkrati pa mora biti metabolno stabilen, dovolj topen v vodnih raztopinah in sposoben prehajati celične membrane. V prvih poskusih razvoja zaviralcev tega encima so skušali posnemati uridin difosfat N-acetilglukozamin. Ti zaviralci so sicer delovali v mikromolarnih koncentracijah, a je bila zaradi njihove neselektivnosti in nezmožnosti prehajanja celičnih membran njihova uporabnost zelo omejena. Sledili so poskusi s hibridnimi zaviralci, ki so bili sestavljeni iz dela uridin difosfata, povezanega s peptidnim mimetikom preko nevtralne verige. Ti so bili sicer dokaj selektivni, vendar zaradi same velikosti molekul prav tako niso bili zmožni prehajati celične membrane. Za najuspešnejše so se do sedaj izkazali nizkomolekularni zaviralci, in sicer spojine iz razreda OSMI. Med njimi je do sedaj največ potenciala pokazala spojina OSMI-4, ki ima odlično selektivnost, hkrati pa lahko njen estrski derivat OSMI-4b, ki je že sam po sebi enako močan zaviralec, prehaja celične membrane. Namen našega dela je bil modificirati spojino vodnico OSMI-4b tako, da bi naslovili njeno slabo topnost, omejeno celično permeabilnost in metabolno (ne)stabilnost. Eno najpomembnejših odkritij je dejstvo, da karboksilat v molekuli OSMI-4 ni ključen za interakcije z encimom, zato je nadomestljiv. Ta karboksilat namreč moli iz vezavnega mesta navzven proti topilu, kar pomeni, da lahko na to mesto namestimo večje fragmente in spremenimo lastnosti celotne molekule, brez da bi izrazito vplivali na njene zaviralne lastnosti in selektivnost delovanja. Na podlagi teh spoznanj smo zasnovali analog z OSMI4 skeletom, ki ima zamenjan karboksilat s piperazinom, pri čemer je ta povezan z amidnim dušikom s tremi ogljikovimi atomi namesto z enim. S tem smo hoteli ustvariti molekulo, ki bi lahko rešila težavo slabe topnosti spojine OSMI-4b v vodnih raztopinah preko tvorbe soli s sekundarnim aminom, hkrati pa bi pridobili metabolično stabilno molekulo, ki ne vsebuje metabolno nestabilne estrske skupine. Da bi naslovili tudi celično permeabilnost, smo v testiranje vključili tudi predhodnik te spojine, ki na sekundarnem aminu piperazina nosi Boc zaščito. Problema stabilnosti in celične permeabilnosti smo se lotili še z drugega vidika, in sicer tako, da smo zasnovali tretji analog, ki vsebuje en dodaten ogljikov atom med karboksilatom in amidom (torej 2), s čimer smo hoteli preprečiti intramolekularno ciklizacijo med karboksilatom in sulfonamidom, ki so jo v eni od študij opazili pri sintezi zaviralca OSMI-4. Hkrati smo molekuli povečali lipofilnost in metabolno stabilnost tako, da smo karboksilatu namesto etilnega estra pripeli bolj voluminozen ciklopentilni ester. Na podlagi kristalografskih slik molekule OSMI-4a v aktivnem mestu encima smo četrtemu analogu dodali klorov atom na petem mestu tiofenskega obroča in tako poskusili vzpostaviti halogensko interakcijo s karbonilnim kisikom fenilalanina 837. Ko smo vse štiri analoge uspešno sintetizirali in očistili, je sledilo biološko testiranje. Rekombinantni humani OGT encim smo inkubirali z desetimi različnimi koncentracijami zaviralcev s tremi ponovitvami pri vsaki od koncentracij določenega zaviralca. Tako pripravljen encim smo dodali mešanici fluorescentno označenega uridin difosfat Nacetilglukozamina in z biotinom označenega akceptorskega polipeptida. Po inkubaciji na sobni temperaturi smo reakcijo ustavili z dodatkom uridin difosfata. V vsako vdolbinico smo dodali magnetne kroglice obdane s streptavidinom, ki vežejo z biotinom označene produkte reakcije med donorjem in akceptorjem, ki jo katalizira ta encim. Na koncu je sledilo še spiranje vdolbinic na magnetni podlagi, meritev intenzitete fluorescence vseh vzorcev ter obdelava podatkov. Rezultati teh meritev so vzpodbudni. Čeprav noben od analogov ni zaviral encima enako močno kot OSMI-4b (IC50 = 0,28 µM), pa so trije od štirih spojin delovale v nizkomikromolarnih koncentracijah. Edina spojina, ki ni izkazovala zaviralnega delovanja, je bil kloro-analog. Dodaten klorov atom je očitno povzročil spremembo pri prileganju inhibitorja v aktivnem mestu spojine, zaradi česar je prišlo do izrazito slabšega zaviranja encima, kot pri ostalih spojinah. Posledično tudi najvišja koncentracija, ki smo jo uporabili (12 µM), ni bila dovolj visoka, da bi kloro-analog znatno zavrl delovanje encima. Po drugi strani pa so bili ostali analogi relativno uspešni: piperazinski analog z Boc zaščito je dosegel IC50 velikosti 2,03 µM, temu je sledil analog s ciklopentilnim estrom (2,33 µM), na zadnjem mestu pa je bil piperazinski analog brez Boc zaščite (4,14 µM). S tem smo potrdili, da je zamenjava etilnega estra v molekuli OSMI-4b za drugačen ester ali celo za popolnoma drugačno skupino možna, brez da bi pri tem signifikantno zmanjšali zaviralni učinek molekule. Ker je ta del molekule usmerjen stran od aktivnega mesta encima, lahko sem pripnemo skupine različnih velikosti, ki bodo omogočile izboljšanje topnosti, celične permeabilnosti in metabolne stabilnosti celotne molekule. Zanimivo je, da je Boc-zaščiten piperazinski analog zaviral encim dvakrat močneje kot analog brez zaščite Boc. To je lahko povezano z ionizacijo tega dela molekule, podobno kot karboksilat OSMI-4a šibkeje zavira encim v primerjavi z njegovim estrskim analogom OSMI-4b. Kljub obetavnosti rezultatov preliminarnih testov, poznavanje samo IC50 vrednosti ni dovolj, da bi si lahko sestavili celotno sliko o vplivu velikosti in ionizacije prej omenjene estrske in drugih skupin na moč zaviralnega delovanja. Zato bo potrebno nadaljnje testiranje teh spojin, da bi ugotovili ostale njihove karakteristike, kot so topnost v vodnih raztopinah, konstanta disociacije (KD), ustreznost prileganja aktivnemu mestu encima z uporabo kristalografskih posnetkov, zmožnost prehajanja celičnih membran in sposobnost zaviranja delovanja Ovezane β-N-acetilglukozamin transferaze v različnih celičnih linijah. Čeprav je dan, ko bomo lahko končno uporabili katerega od zaviralcev tega encima v farmakoterapiji raka ali sladkorne bolezni, verjetno še precej daleč, pa smo trenutno bližje temu cilju kot kadarkoli prej.O-linked N-acetylglucosamine transferase (OGT) is an intracellular enzyme that has been of great interest in the last 20 years. Studies have shown that this enzyme plays a key role in cell cycle regulation, gene expression, cellular stress response, cell signalling, and much more. Moreover, products of this modification are particularly abundant in some cancer cells and cells of diabetic patients, where cell metabolism is known to be upregulated. This disruption of metabolic pathways increases the rate of O-GlcNAcylation, which in turn influences tumour growth and development of insulin resistance. However, before any conclusive therapeutic approaches can be developed, further research is needed to expand the knowledge of this enzyme’s roles. To do so, we need selective and potent inhibitors that are cell-permeable, metabolically stable, and sufficiently soluble in aqueous solutions. In our work, we designed and synthesised four analogues of the most selective and potent small molecule OGT inhibitor, OSMI-4. Since the carboxylate of OSMI-4 is not participating in any significant interactions and protrudes out of the enzyme’s active site, we synthesised an analogue with a piperazine ring linked to the amide nitrogen of the OSMI-4 scaffold via 3 carbon atoms. With this compound, we aimed to address the poor solubility (secondary amine salt formation) as well as metabolic stability of the molecule. To make a more permeable analogue of the first compound, we also decided to use its Boc-protected counterpart as the second final compound. For the third analogue we exchanged the ethyl ester of OSMI-4b for a cyclopentyl ester to make it more resistant to esterases. The last analogue was intended to enhance the interactions in the active site of OGT, so we added a chlorine atom at position 5 of the thiophene ring of OSMI-4b. When all final compounds were successfully synthesised, we verified whether they could still inhibit OGT by measuring their IC50 with a fluorescence activity assay, which included recombinant human OGT. The results show, that much larger substituents can indeed replace the ethyl ester moiety of OSMI-4b without adversely affecting the potency of the inhibitor. On the other hand, the chloro-analogue, which was supposed to outperform the potency of OSMI-4b by establishing an additional halogen interaction in the enzyme’s active site, did not exhibit any inhibitory effect at the concentrations used