Glucotoxicité et altérations de l'expression génique dans les cellules bêta pancréatiques : rôle du facteur de transcription NFkB et du stress du reticulum endoplasmique

In contrast with type 1 diabetes that is caused by autoimmune destruction of pancreatic b-cells, type 2 diabetes (T2D) results from the combination of insulin resistance and defective insulin secretion due to reduced b-cell mass and function. Although the initial cause of such ß-cell dysfunction is not known, it is well established that even moderate hyperglycaemia further alters b-cell function and survival. This process of glucotoxicity contributes thus to the progressive worsening of glucose intolerance in these patients. Therefore, elucidating the molecular mechanisms of b-cell glucotoxicity may provide important insights into the pathophysiology of T2D. Methods: Islets were isolated from male Wistar rats and pre-cultured for one week in the presence of 10 mM glucose. Cell survival, function and gene expression were then measured after further culture for 1 to 7 days in the presence of low, intermediate and high glucose concentrations (2, 5, 10 or 30 mM) plus various test substances. First study: The alterations of ß-cell gene expression by high glucose are similar to those caused by IL-1b, a pro-inflammatory cytokine which triggers ß-cell apoptosis in T1D following the activation of the transcription factor NFB. This suggested that the effects of high glucose may result from the activation of NFkB, likely as a result of oxidative stress. To test this hypothesis, I compared the effects of IL-1ß, high glucose and hydrogen peroxide with or without the antioxidant N-Acetyl-L-cystein (NAC) on NFkB activation and target gene mRNA levels in cultured islets. As expected, exogenous IL-1b rapidly activated NFkB and increased the expression of its target genes c-Myc, Hmox1, iNOS, Fas and IkBa. In contrast, culture in the presence of 30mM glucose (G30) or 50µM hydrogen peroxide stimulated the expression of c-Myc, Hmox1 and Fas without activating NFkB or increasing the expression of its target genes iNOS and IBa. These effects were nevertheless inhibited by NAC and by inhibition of ERK and p38MAPK, suggesting that activation of these kinases by oxidative stress plays a role in ß-cell glucotoxicity. Second study: b-cell protein synthesis (predominantly proinsulin) is markedly stimulated by glucose. When the increase in endoplasmic reticulum (ER) synthetic load exceeds the ER folding capacity, the ER stress sensors IRE1, ATF6 and PERK activate the unfolded protein response (UPR). Although this response usually favours cell survival by reducing protein synthesis and improving the ER folding capacity, its sustained activation may contribute to b-cell apoptosis in T2D. To test this hypothesis, I compared the effects of increasing glucose concentrations and ER Ca2+ emptying with thapsigargin (TG) on rat islet UPR. As expected, TG rapidly induced a full ER stress response with increased Xbp1 pre-mRNA splicing by IRE1, increased mRNA levels of protein chaperones, eIF2a phosphorylation by PERK and subsequent expression of ATF4 and its target genes Gadd34, Atf3 and Chop. In comparison, glucose moderately activated IRE1 as a result of the stimulation of protein synthesis, as shown by the increase in Xbp1 pre-mRNA splicing and expression of chaperones between G5 and G30 and by their inhibition by low cycloheximide concentrations. However, glucose exerted complex effects on events downstream eIF2a phosphorylation. This part of the UPR, which can be activated by other types of stresses and is therefore referred to as the integrated stress response (ISR), was strongly activated in G2-G5, minimal in G10, and slightly increased in G30. This asymmetric V-shaped glucose response curve is similar to that described for b-cell apoptosis under the same culture conditions. These results therefore suggest a causal link between ISR activation and stimulation of ß-cell apoptosis. Conclusion: ß-cell glucotoxicity in cultured rat islets partly results from oxidative stress and ER stress but is independent from NFB activation or IL-1b expression.[...]Contrairement au diabète de type 1 qui fait suite à la destruction des cellules b du pancréas endocrine par un processus auto-immunitaire, le diabète de type 2 (DT2) résulte de la combinaison d'une insulino-résistance et d'un défaut de sécrétion d'insuline par réduction de la masse et de la fonction des cellules b. Si la cause initiale de ce défaut de sécrétion n'est pas connue, il est par contre bien établi que l'hyperglycémie une fois présente contribue aux altérations de fonction et survie des cellules b. Ce processus de glucotoxicité contribue ainsi à l'aggravation progressive de l'intolérance glucidique chez ces patients. L'étude des mécanismes moléculaires de la glucotoxicité dans les cellules b est donc indispensable à une meilleure compréhension de la physiopathologie du DT2. Méthodes: Des îlots isolés de rats mâles Wistar ont été précultivés une semaine en présence de 10 mM glucose. La survie, la fonction et l'expression des gènes ont ensuite été mesurés dans ces îlots cultivés pendant 1 à 7 jours en présence de concentrations de glucose faibles, intermédiaires ou élevées (2, 5, 10 ou 30 mM) et de divers agents pharmacologiques. Première étude: Les altérations d'expression des gènes des cellules b par les concentrations élevées de glucose sont semblables à celles provoquées par l'IL-1b, une cytokine pro-inflammatoire qui déclenche l'apoptose des cellules ß dans le DT1 en activant le facteur de transcription NF B. Ceci suggère que l'hyperglycémie active NFkB, peut-être suite à un stress oxydatif. Pour tester cette hypothèse, j'ai comparé les effets de l'IL-1ß, de concentrations élevées de glucose et du peroxyde d'hydrogène, en présence ou non de l'anti-oxydant N-Acetyl-L-cystéine (NAC), sur l'activation de NFkB et l'expression de ses gènes cibles (ARNm) dans les îlots en culture. J'ai confirmé que l'IL-1b exogène active rapidement NFkB et l'expression de ses gènes cibles c-Myc, Hmox1, iNOS, Fas et IkBa. Par contre, la culture en présence de 30mM de glucose (G30) ou 50µM de peroxyde d'hydrogène stimule l'expression de c-Myc, Hmox1 et Fas mais n'active ni NFkB ni l'expression de ses gènes cibles iNOS et I Ba. Ces effets sont cependant bien inhibés par la NAC et par l'inhibition d'ERK et de p38MAPK, ce qui suggère que l'activation de ces kinases par le stress oxydatif joue un rôle dans la glucotoxicité. Deuxième étude: Les cellules b synthétisent de grandes quantités de protéines et notamment d'insuline en réponse au glucose. Lorsque la synthèse excède la capacité de repliement par le réticulum endoplasmique (RE), les senseurs du stress du RE IRE1, ATF6 et PERK activent la réponse aux protéines mal repliées (UPR). Bien que l'UPR favorise généralement la survie cellulaire en augmentant la capacité du RE à replier les protéines, son activation prolongée pourrait contribuer à l'apoptose des cellules b dans le DT2. Pour tester cette hypothèse, j'ai comparé l'effet de concentrations croissantes de glucose et de la vidange du Ca2+ du RE par la thapsigargine (TG) sur l'UPR dans les îlots de rat. Comme attendu, la TG active très rapidement l'ensemble de l'UPR, avec stimulation de l'épissage du préARNm d'Xbp1 par IRE1, augmentation de l'expression des ARNm des protéines chaperonnes, phosphorylation d'eIF2a par PERK et augmentation consécutive de l'expression d'ATF4 et de ses gènes cibles Gadd34, Atf3 et Chop. En comparaison, le glucose active modérément IRE1 suite à la stimulation de la synth��se prot��ique, comme le montrent l'augmentation de l'épissage du préARNm d'Xbp1 et de l'expression des chaperonnes entre G2-G5 et G30, et leur inhibition par des concentrations faibles de cycloheximide. Par contre, le glucose exerce des effets complexes sur la phosphorylation d'eIF2a et l'augmentation d'expression d'ATF4 et de ses gènes cibles. Cette partie de l'UPR, appelée « réponse intégrée au stress » (ISR), est fortement activée en G2-G5, minimale en G10, et faiblement activée en G30 [...](SBIM 3) -- UCL, 200