Protecting pancreatic b-cells against cytokines: novel function of islet neogenesis associated protein (INGAP) and combinatorial treatment with NF-kB inhibitor SCA-B1-NBD

One of the most challenging health epidemics facing the 21st century is Diabetes Mellitus, characterized by destruction of the insulin-producing β-cells. Inflammation, in particular pro-inflammatory cytokines, plays a key role in initiation and progression of β-cell death. The goal of our research is to develop a novel approach to preserve and expand the pancreatic β-cell mass. This PhD thesis investigates the β-cell protective capacity of two candidate proteins: (i) Islet Neogenesis Associated Protein (INGAP), co-discovered by Dr. Rosenberg as the first neogenic molecule to reverse diabetes by regenerating insulin-producing β-cells (a derived bioactive peptide, INGAP-P, is currently in phase 2 clinical trials); and (ii) a fusion protein, originally engineered at McGill by Dr. Schneider, made up of a β-cell specific single-chain antibody (SCA-B1) fused with an NF-κB inhibitor peptide (NBD) that has been shown to protect mice from streptozotocin-induced diabetes. Hypothesis: In addition to its neogenic properties, INGAP protects β-cells against cytokine-induced cell death by inhibiting cytokine-induced signaling; this effect can be further enhanced by combinatorial treatment with the β-specific NF-κB inhibitor, SCA-B1-NBD. Pre-treatment with recombinant full-length protein INGAP (rINGAP) and INGAP-P partially inhibited cytokine-mediated cytotoxicity, improved viability, reduced NO levels, as well as cytokine-induced apoptosis. While both molecules conferred survival to β-cells, rINGAP appeared to be a more potent and longer-lasting cytoprotective agent compared to INGAP-P. Analysis of signaling events revealed that INGAP partially blocks cytokine-induced apoptosis by inhibiting NF-κB signaling, decreasing phosphorylation of p65, IκBα and kinase complex IKK. INGAP-mediated inhibition of NF-κB signaling was followed by decreased expression of its downstream target, NOS2 gene expression and its gene product, iNOS protein. Our data suggest that rINGAP inhibited cytokine-induced p65 phosphorylation in an IKK-dependent and independent manner. rINGAP partially inhibited other signaling pathways implicated in regulation of iNOS – reduced activation of JAK2 and STAT3, JNK and p38. Finally, cytokine treatment induced early AKT phosphorylation which decreased over time. rINGAP pre-treatment partially inhibited cytokine-mediated effects on AKT.We successfully expressed and purified SCA-B1-NBD and validated its functionality as per: (i) binding β-cells specifically and (ii) partially inhibiting the NF-κB signaling pathway in RINm5F and INS-1 cell lines as well as in human islets. Pre-treatment with SCA-B1-NBD improved viability, reduced cytokine-induced NOS2 expression, iNOS protein and NO levels and partially inhibited apoptosis by decreasing activation of caspase-3 and PARP. Co-treatment of the cell lines with INGAP and SCA-B1-NBD exhibited minimal additive effects against cytokine-induced β-cell death. The limited augmented effects of this combinatorial treatment could be explained in part by the fact that both proteins affect the same signaling pathway, NF-κB. Additional studies, including experimentation with timing and dosage of in vitro administration of each drug as well as in vivo models of diabetes requiring both regenerative and anti-apoptotic interventions, are necessary in order to confidently conclude whether this combinatorial regimen is effective against diabetes.This is the first time INGAP has been shown to protect β-cells against cytokines and to inhibit NF-κB signaling. These studies have broadened our current understanding of INGAP-mediated effects as well as provided novel insight into its anti-apoptotic potential and the underlying intracellular signaling mechanisms. Additionally, successful production and validation of β-cell specific SCA-B1-NBD protective effects have laid the necessary foundation for future in vitro and in vivo studies on pancreatic β-cell mass preservation.Une des pires épidémies de santé du XXIe siècle est le Diabetes Mellitus, caractérisé par la destruction des cellules β productrices d'insuline. L'inflammation, en particulier les cytokines pro-inflammatoires, jouer un rôle clé dans l'initiation et la progression de la mort des cellules β. Le but de notre recherche est de développer une nouvelle approche pour préserver et accroître la masse des cellules β pancréatiques. Cette thèse étudie la capacité protectrice des cellules β de deux protéines candidates: (i) Islet Neogenesis Associated Protein (INGAP), co-découverte par le Dr Rosenberg comme la première molécule néogénique inversant le diabète dans les modèles animaux en régénérant les cellules β productrices d'insuline (son peptide bioactif dérivé, INGAP-P, est actuellement en phase 2 d'essais cliniques); et (ii) une protéine de fusion, initialement conçue à McGill par le Dr Schneider, composée d'un anticorps monocaténaire spécifique de cellules β (SCA-B1) fusionné avec un peptide inhibiteur de NF-κB (NBD) qui protège les souris contre le diabète induit par streptozotocin.Hypothèse: En plus de ses propriétés néogènes, l'INGAP protège les cellules β contre la mort de cellules induite par les cytokines en inhibant la signalisation induite par ces cytokines; cet effet peut être encore amélioré en combinant un traitement avec l'inhibiteur NF-κB, β-spécifique, SCA-B1-NBD.Le prétraitement avec la protéine INGAP recombinante entière (rINGAP) et INGAP-P a partiellement inhibé la cytotoxicité induite par les cytokines, amélioré la viabilité, réduit les niveaux de NO et a aussi réduit l'apoptose induite par les cytokines. Alors que les deux molécules permettent la survie des cellules β, le rINGAP semble être un agent cytoprotecteur plus puissant et plus durable que l'INGAP-P. L'analyse des événements de signalisation a révélé que l'INGAP bloque partiellement l'apoptose induite par les cytokines en inhibant la signalisation de NF-κB, en diminuant la phosphorylation de p65, IκBα et le complexe de kinase IKK. L'inhibition induite par INGAP de la signalisation de NF-κB a été suivie par une expression diminuée de sa cible aval, l'expression du gène NOS2 et de son produit génique, la protéine iNOS. Nos données suggèrent également que rINGAP a inhibé la phosphorylation de p65 induite par les cytokines de manière dépendante et indépendante de l'IKK. rINGAP a partiellement inhibé d'autres voies de signalisation impliquées dans la régulation de iNOS - activation réduite de JAK2 et STAT3, JNK et p38. Enfin, le traitement par les cytokines a induit une phosphorylation précoce de l'AKT qui a diminué avec le temps. Le prétraitement par rINGAP a partiellement inhibé les effets induits par les cytokines sur l'AKT.Nous avons généré et purifié avec succès le SCA-B1-NBD et validé sa fonctionnalité selon: (i) la liaison spécifique aux cellules β et (ii) l'inhibition partielle de la signalisation de NF-κB dans les lignées cellulaires RINm5F et INS-1 ainsi que dans les ilots humains. Le prétraitement avec SCA-B1-NBD a amélioré la viabilité, réduit l'expression de NOS2 induite par les cytokines, de la protéine iNOS et des niveaux de NO et inhibé partiellement l'apoptose en diminuant l'activation de la caspase-3 et de la PARP. Le co-traitement des lignées cellulaires avec INGAP et SCA-B1-NBD a montré des effets additifs minimaux contre la mort des cellules β induite par les cytokines. Les effets positifs limités de ce traitement combinatoire pourraient s'expliquer en partie par le fait que les deux protéines affectent la même voie de signalisation, NF-κB. Des études additionnelles, y compris l'expérimentation avec le temps de l'administration et la posologie in vitro de chaque médicament ainsi que des modèles in vivo de diabète nécessitant à la fois des interventions régénératrices et anti-apoptotiques, sont nécessaires pour conclure avec certitude si ce régime combinatoire est efficace contre le diabète