Role of calcium-independent phospholipase A2 gamma (iPLA2y) in glomerular epithelial cell injury

In experimental membranous nephropathy, complement C5b-9-induces glomerular epithelial cell (GEC)/podocyte injury and proteinuria. The effects of C5b-9 are mediated via signaling pathways, including calcium-independent phospholipase A2γ (iPLA2γ), and mitogen-activated protein kinases (MAPKs) such as extracellular signal-regulated kinase (ERK), c-Jun N-terminal kinase (JNK), and p38. The iPLA2γ pathway is cytoprotective. First, we studied the mechanisms of iPLA2γ activation and cytoprotection. iPLA2γ activitation was monitored by quantifying prostaglandin E2 (PGE2) production. In GECs, iPLA2γ localized at the endoplasmic reticulum and mitochondria, which was dependent on the N-terminal region of iPLA2γ. Complement-mediated production of PGE2 was amplified in GECs that overexpress iPLA2γ, compared with control cells, and was blocked by the iPLA2γ inhibitor bromoenol lactone in both iPLA2γ-overexpressing and control GECs. Complement-induced activation of iPLA2γ was mediated via ERK and p38 pathways, but not JNK pathway. In COS-1 cells that overexpress iPLA2γ and cyclooxygenase-1, PGE2 production was induced by co-expression of constitutively active MEK1 or MAPK interacting kinase 1 (MNK1) as well as by stimulation with epidermal growth factor (EGF) + ionomycin. Complement- and EGF + ionomycin-stimulated iPLA2γ activity was attenuated by the S511A/S515A double mutation. Moreover, complement and EGF + ionomycin enhanced phosphorylation of Ser-511. Thus, stimulation of iPLA2γ was dependent on an increase in cytosolic Ca2+ concentration and phosphorylation of Ser-511 and/or Ser-515 via MNK1. Phosphorylation of Ser-511 and/or Ser-515 plays a key role in the catalytic activity and signaling of iPLA2γ. Next, we addressed the cytoprotective function of iPLA2γ by examining if iPLA2γ is involved in the adaptive unfolded protein response (UPR). In GECs, iPLA2γ amplified tunicamycin-induced activating transcription factor-6 (ATF6) activation and upregulated the ER chaperones, grp94 and grp78, which are downstream of ATF6 and enhance protein-folding capacity of the ER. These effects were dependent on iPLA2γ catalytic activity, but not on prostanoids. Furthermore, ATF6 amplification occurred only when the full length iPLA2γ was expressed, but not an N-terminally truncated mutant, which does not associate with the membrane of the ER. Induction of the ATF6 pathway of the UPR and its amplification by iPLA2γ limited tunicamycin-induced GEC injury. Finally, to better understand the role of iPLA2γ in normal podocyte function and in podocyte injury in vivo, we employed iPLA2γ knockout (KO) mice. Deletion of iPLA2γ caused neither albuminuria nor morphological changes in the glomerulus. However, after induction of anti-glomerular basement membrane nephritis, iPLA2γ KO mice exhibited significantly increased levels of albuminuria, compared to wild type (WT) mice. Furthermore, in contrast to WT mice, iPLA2γ KO mice exhibited a marked loss of podocytes, implying that iPLA2γ has a protective role in glomerulonephritis. Collectively, this work characterizes the mechanism of iPLA2γ activation in complement-mediated GEC injury, shows that the cytoprotective effect of iPLA2γ involves the unfolded protein response, ATF6, and that iPLA2γ has a protective role in glomerulonephritis. Defining the role of iPLA2γ provides opportunities for development of novel therapeutic approaches to GEC injury and proteinuria.Dans la néphropathie membraneuse expérimentale, le complément C5b-9 induit des dommages aux cellules épithéliales glomérulaires (CGE)/podocytes et cause la protéinurie. Les effets du C5b-9 sont médiés par des voies de signalisation, y compris la phospholipase A2γ indépendante du calcium (iPLA2γ), et des protéines kinases activées par les mitogènes (MAPK) telles que ERK, JNK et p38. La voie iPLA2γ est cytoprotectrice. Tout d'abord, nous avons étudié les mécanismes d'activation de et de cytoprotection de iPLA2γ. L'activation de iPLA2γ a été suivie par la quantification de la production de prostaglandine E2 (PGE2). Dans les CGE, iPLA2γ est localisée au réticulum endoplasmique (RE) et aux mitochondries. Cette localisation était dépendante de la région N-terminale de iPLA2γ. La production de la PGE2 induite par le complément était amplifiée dans les CGE qui surexpriment iPLA2γ, par rapport aux cellules de contrôle. Cette amplification était bloquée par un inhibiteur de iPLA2γ (bromoenol lactone) à la fois dans les CGE surexprimant iPLA2γ et les CGE de contrôle. L'activation du iPLA2γ induite par le complément était médiée par des voies de signalisation ERK et p38, mais pas par JNK. Dans les cellules COS-1 qui surexpriment iPLA2γ et la cyclo-oxygénase-1, la production de PGE2 était induite par la co-expression de la kinase constitutivement active MEK1 ou de MNK1 ainsi que par la stimulation par le facteur de croissance épidermique (EGF) + ionomycine. L'activité iPLA2γ stimulé par le complément, EGF et ionomycine, était atténuée par la double mutation, S511A/S515A. En outre, la stimulation par le complément et par la combinaison EGF + ionomycine augmentait la phosphorylation de Ser-511. Ainsi, la stimulation de iPLA2γ était dépendant d'une augmentation de la concentration de calcium cytosolique et de la phosphorylation de Ser-511 et/ou Ser-515 par l'intermédiaire de MNK1. La phosphorylation de Ser-511 et/ou Ser-515 joue un rôle clé dans l'activité catalytique et la signalisation de iPLA2γ.Ensuite, nous avons examiné la fonction cytoprotectrice de iPLA2γ en examinant si iPLA2γ est impliqué dans la ‘‘unfolded protein response'' ou UPR. Dans les CGE, iPLA2γ amplifiait l'activation transcription factor 6 (ATF6) induite par la tunicamycine et a augmentait l'expression des chaperons du RE grp94 et grp78, qui sont en aval du ATF6 et améliorent la capacité de pliage des protéines dans ce compartiment. Ces effets étaient dépendants de l'activité catalytique de iPLA2γ, mais pas des prostanoïdes. En plus, l'amplification de ATF6 se produisait seulement en présence d'une forme intacte de iPLA2γ, mais pas en présence d'un mutant portant une troncation N-terminale et incapable de s'associer avec la membrane du RE. L'induction de la voie de ATF6 de l'UPR et son amplification par iPLA2γ limitait les dommages induits par la tunicamycine dans les CGE.Enfin, pour mieux comprendre le rôle de iPLA2γ dans la fonction normale des podocytes et dans les dommages aux podocytes in vivo, nous avons utilisé des souris knock-out iPLA2γ (KO). La déplétion de iPLA2γ ne cause pas d'albuminurie, ni de changements morphologiques dans le glomérule. Cependant, après l'induction de néphrite par anticorps anti-membrane glomérulaire basale, les souris KO iPLA2γ démontraient une albuminurie augmentée par rapport aux souris de type sauvage (WT). De plus, contrairement aux souris WT, les souris KO iPLA2γ présentaient une diminution marquée des podocytes, ce qui implique que iPLA2γ a un rôle protecteur dans la glomérulonéphrite.Mis ensemble, ces travaux caractérisent le mécanisme d'activation des iPLA2γ dans le dommage aux CGE induit par le complément. Ils montrent que l'effet cytoprotecteur de iPLA2γ implique l'UPR, ATF6, et que iPLA2γ a un rôle protecteur dans la glomérulonéphrite. Définir le rôle de iPLA2γ offre des possibilités pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour les dommages aux CGE et pour la protéinurie