Lactic acid bacteria in mitigation of aflatoxin risk

Tutkielman kirjallisuusosassa käsiteltiin ensin lyhyesti homeita ja mykotoksiineja ja sen jälkeen perehdyttiin aflatoksiineihin, erityisesti aflatoksiineihin B1 (AFB1) ja M1 (AFM1), niiden esiintyvyyteen, merkittävyyteen ja nykyisiin hallintamenetelmiin. Erityisesti paneuduttiin tutkimuksiin, jotka käsittelivät maitohappobakteerien (MHB) kykyä estää aflatoksigeenisten homeiden kasvua ja aflatoksiinien sitomista. Kokeellisen työn tavoitteena oli testata Keniassa valmistetuista, perinteisistä hapatetuista maito- ja maissituotteista eristettyjen MHB-isolaattien (n=171) kykyä (1) estää Aspergillus flavus-homeen kasvua ja (2) sitoa M1 aflatoksiinia in vitro. MHB-isolaattien kykyä estää A. flavus-homeen kasvua testattiin siirrostamalla 100 µl MHB-isolaattia PDA-alustalle (engl. potato dextrose agar) pintaviljelymenetelmällä. Alustavasti 33 MHB-isolaattia näytti vähentävän homeenkasvua ja niistä 19 MHB-isolaattia varmistui jatkokokeissa. Nämä 19 isolaattia testattiin uudelleen siirrostamalla MHB-isolaattia eri määriä (50 µl, 100 µl ja 200 µl) A. flavus-homeen kanssa. Kolme MHB-isolaattia esti A. flavus-homeen kasvua parhaiten kaikilla MHB määrillä. Nämä kolme MHB-isolaattia identifioitiin ensin 16S rDNA sekvenssin perusteella ja varmistettiin myöhemmin recA pohjaisilla alukkeilla Lactobacillus plantarum-lajeiksi. Sitomiskokeissa selvitettiin 171 MHB-isolaatin kykyä sitoa AFM1 PBS-puskuriliuoksessa. MHB-viljelmiä inkuboitiin aflatoksiinia sisältävän liuoksen (50 ng/ml AFM1) kanssa neljä tuntia ja sentrifugoitiin (10 000 rpm, 10 °C) sen jälkeen 15 minuutin ajan, jolloin vapaa AFM1 erottui liuokseen (supernatant) ja sitounut aflatoksiini jäi bakteerisoluja sisältävään sedimenttiin (pelletti). Sitoutuneen aflatoksiinin suhteellinen osuus analysoitiin nestekromatografialla. Tulokset saatiin 51 näytteelle. MHB-isolaattien kyky sitoa AFM1 vaihteli 15,4–51,5 % lisätystä määrästä. Kuusi parhaiten aflatoksiinia sitonutta MHB-isolaattia sitoivat yli 42,4 %. Tulosten perusteella voidaan todeta että kenialaisissa hapanmaito- ja maissituotteissa luontaisesti esiintyvillä MHB-isolaateilla on kykyä estää A. flavus-homeen kasvua ja sitoa AFM1 in vitro. Lisätutkimuksia tarvitaan selvittämään voitaisiinko tällaisia MHB-kantoja käyttää biologisena torjuntamenetelmänä vähentämään aflatoksiiniriskiä rehu-maitoketjussa.The literature review presents general information on fungi and mycotoxins and then deals with aflatoxins, in particular aflatoxin B1 and M1, their occurrence, significance, and current methods for controlling the risk of aflatoxin. Particular emphasis was given to studies on lactic acid bacteria (LAB) in controlling the growth of aflatoxigenic molds and binding of aflatoxins. The aim of the experimental work was to assess the ability of 171 LAB isolates originating from Kenyan naturally fermented traditional milk and maize samples (1) to inhibit the growth of Aspergillus and (2) to bind aflatoxin M1 in vitro. All the LAB isolates (n=171) were screened for their antifungal activity against A. flavus by an overlay method with 100 µl LAB culture on potato dextrose agar (PDA) plate. Out of 171 LAB isolates, mold growth was reduced by 33 isolates, of which 19 isolates were confirmed to retain their activity. These 19 LAB isolates were tested against A. flavus with three different amounts of LAB culture (50 µl, 100 µl and 200 µl). Three LAB isolates performed best against A. flavus by inhibiting the growth with all the tested amounts of LAB culture. The three LAB isolates were identified as Lactobacillus plantarum first by 16S rDNA sequence analysis and later confirmed by recA derived primers and multiplex PCR assay. The ability of 171 LAB isolates to bind AFM1 from phosphate-buffered saline (PBS) in vitro was carried out. LAB isolates were incubated with an amount equivalent to 50 ng AFM1 /ml for 4 h and then centrifuged (10 000 rpm, 10 °C) for 15 min to obtain supernatant containing unbound AFM1. The amount of unbound aflatoxin was analysed by HPLC chromatography from 51 samples. Binding ability of the analyzed isolates varied from 15,4 % to 51,5 %, and six LAB isolates were shown to bind more than 42,4 % of AFM1. The results showed that all tested indigenous LAB isolated from fermented milk and maize products manufactured in Kenya had variable ability to control the growth of A. flavus and bind AFM1 in vitro. It is suggested that such LAB strains could be used for reduction of the risk of aflatoxin contamination in food and feed chains