Detoxification of aflatoxin B1 by microbial binding

Aflatoksiini B1 (AFB1) on luonnossa esiintyvä myrkyllinen yhdiste, jota erityyppiset homesienet tuottavat. AFB1:n esiintyminen elintarvikkeissa ja rehuissa voi johtaa vakaviin sairauksiin, mikä tekee siitä suuren uhan ihmisille ja eläimille. Ilmastonmuutoksen seurauksena AFB1:lla saastuneiden elintarvikkeiden määrä nousee, koska korkea lämpötila ja kosteus edistävät homesienten kasvua ja AFB1:n tuotantoa. AFB1:n biologista hyötyosuutta voidaan vähentää adsorptiolla tai biotransformaatiolla. Adsorptio tapahtuu lisäämällä erilaisia AFB1:a sitovia sidosaineita, jotka voivat olla joko mineraalisia ja orgaanisia sidosaineita tai biologisia sidosaineita. Mineraalisia ja orgaanisia sidosaineita käytetään vain rehuissa, koska ne voivat sitoutua myös ravinteisiin. Biologisia sidosaineita tutkitaan entistä aktiivisemmin, koska ne säilyttävät ruoan ravintoarvon. Tutkimukset ovat osoittaneet, että maitohappobakteereja voidaan käyttää AFB1:n sitomiseen saastuneissa elintarvikkeissa. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia eri maitohappobakteerikantojen (elävien ja elinkyvyttömien solujen) kykyä adsorboida (sitoa) AFB1:a erilaisissa pH-olosuhteissa. Tutkimuksessa arvioitiin 13 elävän ja elinkyvyttömän maitohappobakteerikannan kykyä sitoa AFB1:a pH:n ollessa 7. Parhaiten sitovat kannat valittiin jatkotutkimuksiin, jossa mahalaukun pH:ta jäljiteltiin (pH 3). AFB1:n sitoutuminen soluihin suoritettiin 25℃:ssa 90 minuutin ajan. Sitoutumiskapasiteetin määrittämiseksi liuokset sentrifugoitiin ja vapaa AFB1 supernatantissa uutettiin asetonitriilillä. Näytteiden puhdistamiseen käytettiin nopeaa, helppoa, halpaa, tehokasta, kestävää ja turvallista QuEChERS- näytteenkäsittelymenetelmää. AFB1:n määrä analysoitiin ultrakorkean erotuskyvyn nestekromatografialla yhdistettynä fluoresenssidetektoriin (UPLC-FLD). Tutkimuksessa käytetyillä maitohappobakteerikannoilla osoitettiin olevan kyky sitoa AFB1:a. AFB1:n sitoutumisteho riippui bakteerikannasta. Solujen elinkyky ja pH vaikuttivat myös sitomiskykyyn. Kaikilla elinkyvyttömillä soluilla oli parempi sitomiskyky (44,9–71,3%) verrattuna eläviin soluihin (29,0–49,4%). Maitohappobakteerikannoilla oli myös parempi sitomiskyky alhaisemmassa pH:ssa solujen elinkelpoisuudesta riippumatta. Korkein sitomisteho (71,3%) saavutettiin elinkyvyttömällä Lactobacillus helveticus FAM 22155 -solulla pH 3:ssa. Tämän maisteritutkielman tulokset osoittivat, että jotkut maitohappobakteerikannat sitovat AFB1:a ja sitoutuminen on stabiilia mahalaukun olosuhteissa. Lisätutkimuksia tarvitaan sitoutumisen stabiilisuuden tutkimiseksi simuloiduissa ylemmän ja alemman maha-suolikanavan olosuhteissa (in vitro-ruoansulatus), ja in vivo -tutkimuksia tarvitaan, jotta saadaan lisätodisteita maitohappobakteerien soveltuvuudesta AFB1:n biologisen hyötyosuuden alentamiseen.Aflatoxin B1 (AFB1) is a naturally occurring toxic compound produced by various types of fungi. The presence of AFB1 in food and feed can lead to severe illness, which makes it a serious threat to humans and animals. Due to global climate change, the cases of AFB1 contamination in food will increase since high temperature and humidity favour fungal growth and the production of AFB1. The bioavailability of AFB1 can be decreased by adsorption or biotransformation. Adsorption happens by the utilization of different AFB1 binding agents, which can be either mineral and organic or biological adsorbents. Mineral and organic adsorbents are only used in feed since they may also bind to nutrients. Biological adsorbents are being studied more actively since they maintain the nutritional value of the food. Studies show that Lactic acid bacteria (LAB) can be used to bind AFB1 from contaminated foods. The aim of this research was to study the capacity of different LAB (viable and nonviable) to adsorb (bind) AFB1 under different pH conditions. The research first evaluated the binding ability of AFB1 by 13 viable and nonviable LAB strains at pH 7. The best binding strains were selected for further study at pH 3 to mimic gastric pH. The AFB1 binding with cells was performed at 25℃ for 90 min. To determine the binding capacity, the solutions were centrifuged and free AFB1 in the supernatant was extracted with acetonitrile, and quick, easy, cheap, effective, rugged, and safe (QuEChERS) method was used to clean up the samples. AFB1 concentration was determined by ultra-performance liquid chromatography and fluorescence detection (UPLC-FLD). The LAB strains used in this research were shown to have the ability to bind AFB1. Binding efficacy of AFB1 depended on the bacterial strain. Viability and pH also affected the binding ability. All nonviable cells showed better binding ability (44.9–71.3%) compared to the viable cells (29.0–49.4%). The strains also had better binding capacity at lower pH regardless of the cell viability. The highest binding efficacy (71.3%) was achieved by the nonviable cell of Lactobacillus helveticus FAM 22155 at pH 3. The results of this thesis showed that some LAB strains bind AFB1 and that the binding is stable under stomach conditions. Studies to investigate the stability of the binding under simulated upper and lower gastrointestinal (GI) tract conditions (in vitro digestion) and in vivo studies are needed in order to provide further evidence of the applicability of LAB in lowering the bioavailability of AFB1