Candidate therapeutic targets against acute myeloid leukemia identified via screening combinatorial peptide and chemical libraries

Acute myeloid leukemia (AML), although rare, is highly malignant neoplasms that account for a majority of leukemia-associated deaths. AML results from an over-growth of immature myeloid cells in the bone marrow. These cells are functionally abnormal and interfere with the production of normal hematopoietic cells. Despite apparent phenotypic uniformity, AML is a heterogeneous group of myeloid malignancies, in which multiple genetic and epigenetic aberrations accumulate in hematopoietic stem or progenitor cells leading to disturbed cellular growth, proliferation, and differentiation. The nature and number of these AML-associated molecular abnormalities can vary widely among patients. Accordingly, the survival rate also fluctuates greatly, with an average ~25% overall survival rate. Chemotherapy is currently the mainstay treatment option for the patient with AML. However, although required to induce initial remission, chemotherapy contributes to new mutations and clonal evolution, which often leads to disease relapse. Consequently, targeted therapies are urgently needed to eradicate AML cells. One of the major challenges in clinical oncology today is that therapeutic agents cannot be selectively delivered to tumor site without causing toxicity to rest of the body. In addition, tumor microenvironment has a key role in mediating drug efficacy and resistance, which hampers the discovery of clinically relevant drugs. Therefore, functional screening platforms that can identify cancer-specific targets as well as assess the therapeutic relevance of drug candidates within the appropriate disease microenvironment are fundamental in identification of novel targets and therapeutic agents with better attributes than conventional chemotherapy drugs. In our studies, we have used two discovery approaches: (i) a phage display technology that allows the identification of ligands binding to physiologically relevant targets, and (ii) a novel ex vivo screening assay, which allows identification of candidate drugs against leukemia that are effective in the presence of human blood and bone marrow components. Specifically, our studies have elucidated the function of the leukemia invadosome a supramolecular complex containing certain β2 integrins and matrix metalloproteinases in the context of extramedullary leukemia. We show that this complex is essential for extravasation of leukemia cells as well as for leukemia cell growth, and that blocking the function of this complex possesses potent anti-leukemia and anti-invasion effects. We also demonstrate new roles for neuropilin-1 and interleukin-11 receptors in the pathogenesis of leukemia. We show that these membrane-associated proteins are highly expressed in leukemia cell lines as well as in bone marrow samples from leukemia patients. In addition, we show that the ligands binding to these receptors can be utilized in targeted drug delivery. Finally, we developed a new functional ex vivo screening assay to identify candidate anti-leukemia agents in the presence of human blood or bone marrow under hypoxic conditions. Under these conditions, leukemic cells deplete oxygen faster than normal cells causing a shift in the hemoglobin oxygenation state. This shift, detected by measuring the optical density at 600 nm (OD600) after an appropriate incubation time, directly correlates with leukemic cell counts. Thereby, the oxygenation state of native hemoglobin serves as a reliable and reproducible built-in indicator of leukemia cell growth and/or viability. Our study showed that this assay is highly amenable for high-throughput screening against leukemia. Our results support the idea that this new methodology could be a tool for the prediction of drug efficacy and/or response in leukemia patients.Akuuti myelooinen leukemia (AML) on harvinainen hematologinen syöpämuoto, joka esiintyy lähinnä vanhemmalla väestöllä. AML aiheutuu, kun useita erilaisia mutaatioita sekä kromosomi- ja epigeeneettisiä muutoksia kerääntyy myeloidisiin kantasoluihin johtaen hallitsemattomaan solujakautumiseen sekä soluerilaistumisen estymiseen. AML solut eivät ole toiminnallisesti normaaleja ja häiritsevät normaalien verisolujen tuotantoa. Vaikka AML solut ovat fenotyyppisesti samankaltaisia, ne ovat käytännössä hyvin heterogeeninen joukko soluja, jotka voidaan jakaa useaan erilaiseen alaryhmään. Molekulaaristen muutosten määrä ja laatu eri AML potilailla voi vaihdella suuresti. Sytostaatti- eli solusalpaaja lääkitys on AML:n ensisijainen hoitomuoto. Nämä lääkkeet estävät solujakautumista, ja tuhoavat samalla myös jakautuvia normaalisoluja. Vaikka solusalpaajat usein aikaansaavat paranemisen, joka määritellään oireiden katoamisella ja veriarvojen normalisoitumisella (remissio), sytostaattihoito usein aiheuttaa uusia mutaatioita sekä klonaalista evoluutiota, jotka johtavat taudin uusiutumiseen. Tästä johtuen pitkäaikainen kokonaisremissio saavutetaan vain noin 25% AML tapauksista. Kohdennettuja terapiamuotoja, jotka toimittavat lääkeaineet selektiivisesti ja spesifisesti syöpäsoluihin aiheuttamatta toksisuutta muualla elimistössä tarvitaan täten AML:n hoitoa varten. Uusien parempien syöpäkohteiden sekä terapeuttisten lääkeaineiden löydössä olennaisessa asemassa ovat toiminnalliset seulontamenetelmät, jotka kykenevät erottamaan syöpäspesifiset kohteet sekä arvioimaan lääkeaineiden terapeuttisen mahdollisuuden sekä toimivuuden taudille ominaisessa mikroympäristössä. Olemme käyttäneet tässä väitöskirjatyössä kahta erilaista seulontamenetelmää: (i) faaginäyttö seulontamenetelmää, joka mahdollistaa fysiologisesti tärkeiden syöpäspesifisten kohteiden löytämisen, sekä (ii) ex vivo seulontamenetelmää, joka mahdollistaa lääkeaineiden arvioinnin ihmisperäisten komponenttien läsnäollessa, täten kasvattaen todennäköisyyttä, että kyseiset lääkeaineet ovat toiminnallisia myös potilaan elimistössä. Tutkimuksessamme olemme valaisseet leukemia invadosomin toimintaa. Kyseinen invadosomi on proteiinikompleksi, joka koostuu β2 integriineistä ja matriksimetalloproteiineista, ja on tärkeä erityisesti leukemiasolujen liikkumiselle ja leviämiselle elimistössä. Osoitamme, että faaginäyttömenetelmällä löydetyt peptidit, jotka kohdentavat kyseistä proteiinikompleksia, ovat uusia mahdollisia lääkeaineita, joilla on sekä invaasioita ja solukasvua estäviä vaikutuksia leukemiassa. Lisäksi, tutkimuksemme osoittaa, että neuropiliini-1 ja interleukiini-11 reseptorit ovat patogeenisesti olennaisia leukemiassa. Osoitamme, että molemmat reseptorit ilmentyvät epänormaalia enemmän leukemiasoluissa verrattuna normaali soluihin. Osoitamme myös, että faaginäyttömenetelmällä löydettyjä peptideitä, jotka sitoutuvat kyseisiin reseptoreihin, voidaan käyttää lääkeaineiden syöpäspesifiseen kohdentamiseen. Lopuksi, kehitimme uuden toiminnallisen ex vivo seulontamenetelmän, jonka tarkoitus on edesauttaa tehokkaiden lääkeaineiden löytäminen ja arvioiminen. Tämä menetelmä pyrkii jäljittelemään taudin mikroympäristöä elimistössä, joka tunnetusti heikentää ja vastustaa lääkeaineiden toimivuutta. Uusi menetelmä ottaa huomioon muiden ihmisperäisten solujen läsnäolon sekä saatavilla olevan happen määrän, ja mahdollistaa mm. lääkeaineiden tehokkuuden arvioimisen potilaan omassa veressä tai luuydinnäytteessä ennen lääkkeen antamista potilaalle. Kyseinen menetelmä on mahdollisesti hyödyllinen parhaan hoitomuodon valitsemisessa kullekin leukemia potilaalle