Characterization of diagnostic biomarkers for Mycobacterium tuberculosis infection

Tuberculosis (TB) still ranks among the most lethal infectious diseases in the world. The traditional distinction between active tuberculosis and latent tuberculosis infection (LTBI) is changing; at the moment, tuberculosis infection is described as a continuum with different stages of infection. The development of TB prevention, treatment and diagnostics is hampered by the diverse pathogenesis of the disease and the ability of the bacteria to fight host defence mechanisms. Traditional culture methods are slow and staining methods not sufficiently sensitive. Nucleic acid amplification techniques (NAAT) tend to be costly and in some cases lack sensitivity. New methods are needed for rapid and inexpensive detection of active disease and to distinguish between stages of infection in cases where the patient presents with symptoms compatible with active TB and with a positive Interferon Gamma Release Assay (IGRA) result, but bacteriological confirmation is not yet available. In addition, methods are needed that enable us to predict the activation of infection or monitor the effects of treatment. The aim of this thesis was to investigate: a) the possible diagnostic use of heparin-binding haemagglutinin (HBHA), a surface protein of M. tuberculosis, in distinguishing between stages of infection in a vaccinated population; b) the effect of sample concentration on the properties of Clearview® TB ELISA, a urine antigen test measuring lipoarabinomannan (LAM), a M. tuberculosis glycolipid, in the diagnosis of active TB; c) the suitability of granzyme B (GrB), perforin (Prf), and interferon-gamma (IFN-γ)-producing and CD107a-degranulation factor-expressing cytotoxic T lymphocytes (CTLs) for differentiating between stages of infection; d) the suitability of IFN-γ, interleukin (IL) -17, IL-4, IL-4δ2 and Forkhead box P3 (FoxP3) mRNA expression levels for differentiation between stages of infection. The results showed that HBHA-specific cells producing IFN-γ were also found in the circulation of healthy subjects who had been given the Bacillus Calmette-Guérin vaccine. In view of this, use of the HBHA antigen for diagnostic purposes does not look promising in countries where a widespread vaccination programme has taken place. No differences were found in the numbers or phenotypic properties of CTLs between persons with active TB and those with LTBI, which is why they are not suited for the differential diagnosis of infection stages. Functional antigen-specific CTLs were found in the circulation of persons who had been treated for TB. This most significant finding of this thesis demonstrates that the T cell memory generated by active TB maintains functionally active CTL populations decades after infection and despite adequate treatment with rifampicin. Although no statistically significant differences were found between patients with active TB and LTBI in the quantitative detection of IFN-γ, IL-17, or IL-4 mRNA from cells stimulated with purified protein derivative (PPD), this approach revealed a trend towards discrimination. The usefulness of combined quantitative IFN-γ, IL-17, and IL-4 mRNA expression for the differential diagnosis of active TB and LTBI should be retested with a larger sample size enrolling more homogenous patients in the LTBI group. The findings indicating that LAM may be detected with moderate sensitivity (57%) in the urine samples of TB patients show the greatest promise from a diagnostic point of view. The 100-fold concentration of urine used in this study improved the sensitivity of the Clearview® TB ELISA test from 7% to 57%, although specificity was decreased somewhat from 98% to 89%. Based on the results, demonstrating the presence of LAM in urine samples may be considered a potential diagnostic tool for detecting active TB. The method does require further development, however.Tuberkuloosi (TB) kuuluu vielä nykyisinkin tappavimpiin tartuntatauteihin maailmassa. Perinteinen jako aktiiviseen ja latenttiin tuberkuloosiin (LTBI) on muuttumassa; nyttemmin tuberkuloosi-infektio kuvataan vaihteleva-asteisena jatkumona. Patogeneesin monimuotoisuus ja bakteerin kyky torjua isännän puolustusmekanismeja hankaloittavat ennaltaehkäisyn, hoitomenetelmien ja diagnostiikan kehitystä. Perinteisen TB-viljelyn heikkoutena on hitaus, ja värjäys tiedetään epäherkäksi. Geenimonistusmenetelmien käyttöä puolestaan rajoittaa hintavuus eikä niiden herkkyys aina riitä. Uusia keinoja kaivataan taudin nopeaan ja edulliseen osoittamiseen sekä infektion asteiden erotteluun esimerkiksi tilanteissa, joissa potilaalla on aktiiviseen tuberkuloosiin viittaavia oireita ja positiivinen gammainterferoni (IGRA) -tulos, mutta bakteriologinen varmistus puuttuu. Lisäksi tarvitaan menetelmiä, joilla voidaan ennustaa infektion aktivoitumista tai seurata hoidon vaikutuksia. Tässä väitöskirjatyössä selvitettiin: a) M. tuberculosis pintaproteiinin, heparin-binding hemagglutiniinin (HBHA), diagnostista käyttömahdollisuutta eroteltaessa rokotetussa väestössä infektion eri asteita; b) konsentroinnin vaikutusta M. tuberculosis bakteerin glykolopidiä, lipoarabinomannaania (LAM), mittaavan virtsan antigeenitestin, Clearview® TB ELISA:n, ominaisuuksiin aktiivi-TB-diagnostiikassa; c) granzyme B:tä (GrB), perforiiniä (Prf) ja gammainterferonia (IFN-γ) tuottavien sekä CD107a-degranulaatiofaktoria ekspressoivien sytotoksisten T-lymfosyyttien soveltuvuutta infektion asteiden erotteluun; d) IFN-γ, interleukiini (IL) -17, IL-4, IL-4δ2 ja Forkhead box P3 (FoxP3) -mRNA-ekspressiotasojen toimivuutta infektion asteiden erottelussa. Tutkimuksessa löydettiin myös terveiden Bacillus Calmette-Guérin (BCG) -rokotteen saaneiden verestä HBHA-spesifisiä, IFN-γ:aa tuottavia soluja. HBHA-antigeenia ei siis voitane hyödyntää diagnostiikassa maissa, joissa rokotusohjelmaan on kuulunut lasten BCG-rokotus. Aktiivi-TB- ja LTBI-ryhmien välillä ei havaittu määrällisiä eikä fenotyyppisiä eroavuuksia sytotoksissa T-lymfosyyteissä, joten ne eivät sovellu käytettäviksi infektion asteiden erotusdiagnostiikassa. Toiminnallisia antigeenispesifisiä sytotoksisia T-lymfosyyttejä havaittiin myös tuberkuloosihoidon saaneiden verinäytteissä. Tämä on väitöskirjan arvokkain löydös. Se osoittaa, että aktiivi-TB:n aikaansaama T-solumuisti ylläpitää toiminnallisesti aktiivista sytotoksisten T-solujen populaatiota vuosikymmeniä, asianmukaisesta rifampisiinihoidosta huolimatta. Vaikka IFN-γ-, IL-17- ja IL-4 mRNA -ekspressiotasoissa ei esiintynyt tilastollisesti merkitseviä eroja purified protein derivative (PPD) -stimuloiduissa soluissa, aktiivi-TB- ja LTBI-ryhmien välillä oli nähtävissä erotteleva suuntaus. IFN-γ-, IL-17- ja IL-4 mRNA- ekspression hyödyntämistä aktiivi-TB:n erottamiseksi LTBI:stä tulisikin tulevaisuudessa testata suuremmalla ja yhtenäisemmällä LTBI-aineistolla. Diagnostiikan kannalta lupaavampia ovat tulokset, joiden perusteella LAM voidaan osoittaa tuberkuloosipotilaiden virtsanäytteestä kohtalaisella herkkyydellä (57%). Tässä työssä käytetty virtsan satakertainen konsentrointi paransi Clearview® TB ELISA testin herkkyyttä 7%:sta 57%:iin; spesifisyys tosin samalla heikkeni 98%:sta 89%:iin. LAM:n osoittamista virtsanäytteestä voidaan mahdollisesti hyödyntää aktiivi-TB:n diagnosoinnissa, tosin menetelmä vaatisi vielä kehittämistä