Transcriptional analysis of persistent Chlamydia pneumoniae infection in vitro

Chlamydia pneumoniae can cause acute respiratory infections including pneumonia. Repeated and persistent Chlamydia infections occur and persistent C. pneumoniae infection may have a role in the pathogenesis of atherosclerosis and coronary heart disease and may also contribute to the development of chronic inflammatory lung diseases like chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and asthma. In this thesis in vitro models for persistent C. pneumonia infection were established in epithelial and monocyte/macrophage cell lines. Expression of host cell genes in the persistent C. pneumoniae infection model of epithelial cells was studied by microarray and RT-PCR. In the monocyte/macrophage infection model expression of selected C. pneumoniae genes were studied by RT-PCR and immunofluorescence microscopy. Chlamydia is able to modulate host cell gene expression and apoptosis of host cells, which may assist Chlamydia to evade the host cells' immune responses. This, in turn, may lead to extended survival of the organism inside epithelial cells and promote the development of persistent infection. To simulate persistent C. pneumoniae infection in vivo, we set up a persistent infection model exposing the HL cell cultures to IFN-gamma. When HL cell cultures were treated with moderate concentration of IFN-gamma, the replication of C. pneumoniae DNA was unaffected while differentiation into infectious elementary bodies (EB) was strongly inhibited. By transmission electron microscopy small atypical inclusions were identified in IFN-gamma treated cultures. No second cycle of infection was observed in cells exposed to IFN-gamma , whereas C. pneumoniae was able to undergo a second cycle of infection in unexposed HL cells. Although monocytic cells can naturally restrict chlamydial growth, IFN-gamma further reduced production of infectious C. pneumoniae in Mono Mac 6 cells. Under both studied conditions no second cycle of infection could be detected in monocytic cell line suggesting persistent infection in these cells. As a step toward understanding the role of host genes in the development and pathogenesis of persistent C. pneumoniae infection, modulation of host cell gene expression during IFN-gamma induced persistent infection was examined and compared to that seen during active C. pneumoniae infection or IFN-gamma treatment. Total RNA was collected at 6 to 150 h after infection of an epithelial cell line (HL) and analyzed by a cDNA array (available at that time) representing approximately 4000 human transcripts. In initial analysis 250 of the 4000 genes were identified as differentially expressed upon active and persistent chlamydial infection and IFN-gamma treatment. In persistent infection more potent up-regulation of many genes was observed in IFN-gamma induced persistent infection than in active infection or in IFN-gamma treated cell cultures. Also sustained up-regulation was observed for some genes. In addition, we could identify nine host cell genes whose transcription was specifically altered during the IFN-gamma induced persistent C. pneumoniae infection. Strongest up-regulation in persistent infection in relation to controls was identified for insulin like growth factor binding protein 6, interferon-stimulated protein 15 kDa, cyclin D1 and interleukin 7 receptor. These results suggest that during persistent infection, C. pneumoniae reprograms the host transcriptional machinery regulating a variety of cellular processes including adhesion, cell cycle regulation, growth and inflammatory response, all of which may play important roles in the pathogenesis of persistent C. pneumoniae infection. C. pneumoniae DNA can be detected in peripheral blood mononuclear cells indicating that the bacterium can also infect monocytic cells in vivo and thereby monocytes can assist the spread of infection from the lungs to other anatomical sites. Persistent infection established at these sites could promote inflammation and enhance pathology. Thus, the mononuclear cells are in a strategic position in the development of persistent infection. To investigate the intracellular replication and fate of C. pneumoniae in mononuclear cells we analyzed the transcription of 11 C. pneumoniae genes in Mono Mac 6 cells during infection by real time RT-PCR. Our results suggest that the transcriptional profile of the studied genes in monocytes is different from that seen in epithelial cells and that IFN-gamma has a less significant effect on C. pneumoniae transcription in monocytes. Furthermore, our study shows that type III secretion system (T3SS) related genes are transcribed and that Chlamydia possesses a functional T3SS during infection in monocytes. Since C. pneumoniae infection in monocytes has been implicated to have reduced antibiotic susceptibility, this creates opportunities for novel therapeutics targeting T3SS in the management of chlamydial infection in monocytes.Geenien poikkeavasta ilmenemisestä mahdollisesti apua kroonisen keuhkoklamydian tunnistukseen ja hoitoon Keuhkoklamydia on Suomessa erittäin yleinen hengitystieinfektio. Krooninen keuhkoklamydiainfektio voi olla yksi tekijä, joka vaikuttaa sydän- ja verisuonitautien kehittymiseen, ja sillä saattaa olla rooli myös keuhkoahtaumataudin ja astman taudinkuvassa. Nämä krooniset taudit ovat merkittävä kansanterveysongelma, ja ne kuormittavat terveydenhuoltoa ja kansantaloutta. Vaikka keuhkoklamydiaan tehoavat useat antibioottilääkkeet, kroonisessa infektiossa se näyttää olevan vastustuskykyinen lääkehoidoille. Keinoa kroonisen keuhkoklamydiainfektion luotettavaan tunnistamiseen ei toistaiseksi ole. Nyt julkaistavassa väitöstutkimuksessa tunnistettiin useita keuhkoklamydian ja ihmisen geenejä, joista saattaa olla apua kroonisen infektion tunnistamisessa ja hoidossa. Lisäksi nyt tunnistetuilla, kroonisessa infektiossa poikkeavasti ilmenevillä geeneillä saattaa olla vaikutusta kroonisen keuhkoklamydiataudin kehittymiseen. Tutkimuksessa havaittiin, että krooninen keuhkoklamydiainfektio muuttaa ihmisen solun geenien ilmenemistä. Työssä tunnistettiin lisäksi keuhkoklamydian geeni, jonka tuotteella (RNA:lla tai valkuaisaineella) on potentiaalia biomerkkiaineeksi, jonka avulla krooninen keuhkoklamydiainfektio voitaisiin tunnistaa tulevaisuudessa. Tutkimuksessa havaittiin myös, että keuhkoklamydian tietty valkuaisaineiden eritysreitti on toiminnallinen myös monosyytti-infektion aikana. Havaittu eritysreitti on myös potentiaalinen lääkehoidon kohde. Tulevaisuudessa kroonisen keuhkoklamydiainfektion hoito voitaisiin ehkä kohdistaa monosyytteihin eli veressä kiertäviin valkosoluihin ja täten ehkäistä klamydiabakteerin leviämistä elimistössä ja mahdollista kroonisen taudin syntyä keuhkojen ulkopuolella. Geenien erilaisesta aktiivisuudesta mahdollinen apu tautidiagnostiikkaan Tässä työssä keuhkoklamydian ja ihmisen solun vuorovaikutuksia tutkittiin tätä varten pystytetyissä soluviljelymalleissa. Ihmisen solun geenien ilmenemistä peittosolujen kroonisessa keuhkoklamydiainfektiomallissa tutkittiin DNA-sirulla, joka sisälsi 4000 ihmisen geeniä. Tutkimuksessa havaittiin, että kroonisessa infektiossa monet solun geenit ilmenivät voimakkaammin ja usein pidempään verrattuna akuuttiin infektioon. Lisäksi tutkimuksessa tunnistettiin yhdeksän geeniä, joiden ilmeneminen liittyi erityisesti krooniseen keuhkoklamydiainfektioon. Keuhkoklamydian geenien ilmenemistä tutkittiin ihmisen monosyyttisoluissa geenimonistustekniikan avulla. Ensisijainen kiinnostuksen kohde oli tutkia geenejä, joiden tuottamat valkuaisaineet eritetään isäntäsoluun infektion aikana sekä sellaisia geenejä, jotka aikaisempien tutkimusten perusteella ilmenivät poikkeavasti peittosolujen kroonisessa infektiomallissa. Yhden näistä peittosoluissa poikkeavalla tavalla ilmenevistä geeneistä havaittiin ilmenevän samankaltaisesti myös monosyyteissä. Nämä tutkimustulokset antavat viitteitä siitä, että kyseistä geenituotetta voitaisiin tulevaisuudessa mahdollisesti käyttää kroonisen infektion tunnistamiseen. Estäjämolekyyleistä mahdollinen hoitokeino Tutkimuksessa osoitettiin ensimmäistä kertaa tiettyjen klamydiageenien ilmentyminen ja valkuaisaineiden erittyminen ihmisen monosyyttisoluihin infektion aikana. Yhden näistä tutkituista proteiineista on osoitettu aiemmin erittyvän keuhkoklamydian niin sanotun tyyppi III -eritysreitin avulla. Tätä eritysreittiä vastaan on olemassa estäjämolekyylejä, jotka pysäyttävät keuhkoklamydian kasvun peittosoluissa. Koska tutkimuksessa havaittiin, että tyyppi III -eritysreitti on toiminnallinen myös monosyyteissä, luo se mahdollisuuden, että tunnetuilla estäjämolekyyleillä voidaan tulevaisuudessa hoitaa kroonista keuhkoklamydiainfektiota ja estää bakteerin leviämistä elimistössä. Hyvin kannustavista tuloksista huolimatta lisätutkimuksia tarvitaan, jotta ymmärrettäisiin paremmin nyt tunnistettujen keuhkoklamydian ja ihmisen geenituotteiden mahdollinen merkitys kroonisen taudin kehittymisessä ja jotta kroonisen keuhkoklamydiainfektion tunnistamiseen ja hoitoon saataisiin uusia työkaluja