MOLECULAR DETECTION OF RESPIRATORY PATHOGENS – A SYNDROMIC APPROACH. Focus on immunocompromised adult patients.

Les infections respiratoires sont les complications infectieuses les plus fréquentes chez les patients immunodéprimés, et sont parmi les causes principales de morbidité et mortalité. Dans le but d’améliorer et d’étendre le diagnostic des pathogènes respiratoires, nous avons introduit au laboratoire une méthode de biologie moléculaire qui permet une approche syndromique, c.-à-d. qu’elle permet de détecter plusieurs micro-organismes responsables d’un même syndrome clinique en une seule étape. Nous avons choisi la technologie des « TaqMan® Array Cards » (TAC), qui permettent de détecter jusqu’à 48 cibles (virales, bactériennes et fongiques) à la fois. Cette technique permet de créer des panels complètement sur-mesure et elle est particulièrement intéressante pour les patients immunodéprimés, une population pour laquelle un diagnostic rapide et correct est crucial pour une prise en charge appropriée du patient. Dans un premier temps, nous avons démontré une valeur ajoutée importante des TACs respiratoires aux méthodes conventionnelles pour le diagnostic d’infections virales respiratoires chez les patients immunodéprimés. Grâce à une meilleure sensibilité et un spectre de détection plus large, le taux de positivité des TACs étaient de 54%, comparé à 19% pour les méthodes conventionnelles. Une deuxième étude nous a permis d’étudier la place des TAC au sein de notre laboratoire clinique. La méthode des TAC a été comparé avec une autre méthode en biologie moléculaire (Simplexa™ Direct assay) pour la détection d’influenza virus et RSV, en termes de performance analytique. Le taux de positivité, les coûts, et le délai de réponse ont également été comparés. La sensibilité et spécificité pour l’influenza et RSV de la méthode Simplexa™ étaient comparables à celles du TAC. Par contre, grâce au large spectre de détection du TAC, le taux de positivité était de 62%, contre 16% pour Simplexa™. Le coût des TAC s’est avéré raisonnable en tenant compte du grand nombre de cibles. Le délai de réponse des TAC dépend largement du nombre d’échantillons respiratoires et de l’organisation du laboratoire. Dans un laboratoire dont le departement de biologie moléculaire n’est pas déployé en dehors des heures d’ouverture normales et non plus pendant le weekend, la combinaison d’une technique moléculaire rapide et disponible 24h/24 et 7j/7 pour la détection de ces pathogènes viraux les plus importants, avec les TAC en deuxième ligne pour les patients à haut risque pourrait offrir une solution. Dans la troisième partie de notre travail, nous avons effectué une étude bi-centrique pour continuer à cartographier l’épidémiologie chez un grand nombre de patients immunodéprimés, et nous avons exploré l’impact clinique des pathogènes respiratoires recherchés. Cette étude a démontré un lien entre la présence d’un pathogène respiratoire et la nécessité d’oxygène supplémentaire. Cette association était toujours valable après l’exclusion des résultats positifs pour influenza, étayant que les virus non-influenza contribuent à une maladie respiratoire sévère dans les patients immunodéprimés. Finalement, nous avons développé notre propre TAC panel respiratoire, en collaboration avec la firme Thermo Fisher Scientific. La première phase, celle du développement de la technique, a compris le choix des pathogènes à inclure, le choix de(s) gène(s) cible(s) pour chaque pathogène, la conception et la validation de chaque ensemble d’amorces et de sondes séparément. Durant cette première phase, nous avons développé et testé 90 PCR différentes. Puis, nous avons sélectionné les 48 PCR à inclure dans notre panel, et ces séquences ont été utilisées pour la fabrication des cartes sur mesure. Ensuite, les cartes ont été validées analytiquement et cliniquement. Finalement, nous avons implémenté cette technique « en routine ». Les patients de l’hôpital Erasme peuvent désormais bénéficier de cette nouvelle technologie de pointe. Avec nos recherches, nous espérons avoir contribué à une amélioration du diagnostic et de la qualité de la prise en charge des patients immunodéprimés atteints d’une infection respiratoire.Respiratory tract infection is the most frequent infectious complication in immunocompromised hosts, and is among the leading causes of morbidity and mortality. In this population, rapid and accurate diagnosis of respiratory pathogens is crucial for appropriate clinical management. The main objective of this work was to improve the detection of respiratory pathogens in this patient group, by means of a syndromic molecular approach. The Taqman® Array Card technology was chosen and viruses, «atypical » bacteria and fungi were selected as targets. We demonstrated that a customized TAC panel had a higher sensitivity in comparison to conventional methods for the detection of respiratory viruses (41% versus 18%; P 0.1). Simplexa™ testing found 16% samples positive with one pathogen each, the TAC assay identified 62% of samples with one or more respiratory pathogens. More than half(54%) of Simplexa™ negative samples were positive by TAC for other pathogens than RSV, Flu A and B. The estimated costs and TAT were 31.8€ and 1.5 hours for Simplexa™ and 56€ and 6 hours for TAC testing. Our two-center study described the epidemiology of respiratory pathogens in a large group of symptomatic immunocompromised patients and provided evidence of a relationship between pathogen detection and the need for supplemental oxygen. This association was still found after the exclusion of the results positive for influenza viruses, substantiating that non-influenza viruses contribute to severe respiratory illness in patients with compromised immunity. Hospital and ICU admission rates were 84% and 11% respectively. The co-infection rates were comparable in our studies, ranging from 12 to 17%. It should be noted however that not all respiratory pathogens were included as targets, so the true co-infection rate is likely higher. The pre-existing TAC used in the above mentioned studies is very complete. Nevertheless, we developed and validated a respiratory TAC, using sequences designed and supported by the manufacturer and included additional pathogens specific for immunocompromised patients. In total, 90 assays were tested in 96-well plates, of which 43 were retained for further validation in TAC format. All tested assays showed excellent analytical sensitivity, with LoD ranging from 1 to 100 copies/µL. An overall specificity of 99.96% was found. Reproducibility ranged from 76%- 100%, with a mean of 91%. For the clinical validation, a total number of 428 samples were tested, with an overall positivity rate of 56.3% and a co-infection rate of 15.9%. 15 results (4% of total number of positives) were not confirmed and considered false positives. One result (0.2%) was considered false negative. This syndromic panel was implemented for routine respiratory testing in the Erasme University Hospital in high risk patient populations. This PhD adds to the growing body of literature regarding the epidemiology of viral, atypical bacterial and fungal respiratory pathogens in adult immunocompromised patients. Our studies have confirmed the added value of a syndromic panel in respiratory diagnostics, and we outlined the development, validation and use of TACs in the clinical diagnostic laboratory in this high risk patient population.Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine)