Recherche de nouveaux agents pathogènes associés aux pneumopathies nosocomiales

Récemment, les microbiotes pulmonaires bactériens d’un nombre très limité de patients atteints de mucoviscidose et de pneumopathies acquises sous ventilation mécanique (PAVM) ont été étudiés en utilisant l'amplification du gène 16S rDNA bactérien suivie par la construction de librairies de clones et différentes approches de séquençage. Ces études ont montré que la population microbienne de patients atteints de maladies respiratoires était plus diversifiée que prévue. Dans l'étude actuelle, nous utilisons une approche comparable pour identifier exhaustivement les agents pathogènes (bactéries, virus, et champignons) composant le microbiote pulmonaire associé aux pneumopathies développées en unités de réanimation. L'étude a inclus des patients admis en réanimation et présentant des formes de pneumopathies acquises sous ventilation mécanique (n = 106), de pneumopathies communautaires (n = 32), de pneumopathies nosocomiales sans ventilation mécanique (n = 22) et de pneumopathies d’aspiration (n = 25). Une cohorte de 25 patients admis en réanimation et ne présentant pas de symptômes de pneumopathie a été étudiée comme contrôle. Cette première partie du travail amènera ainsi à réaliser un catalogue exhaustif des agents de pneumopathies nosocomiales ; à connaître la prévalence des agents identifiés et d’identifier les co-infections fréquemment observées, et surtout à vérifier si ces agents peuvent être identifiés ou pas dans les prélèvements respiratoires profonds de patients non symptomatiques. Pour réaliser cette partie du travail, des séries de prélèvements, incluant des prélèvements de lavage broncho-alvéolaire (LBA), des prélèvements de sang et d'urine ont été étudiés. Ces prélèvements ont été testés par des moyens d’identification moléculaire moderne basés sur l’amplification de gènes conservés (gènes16S rDNA des bactéries et gène 18S rDNA des champignons) suivie par clonage et séquençage à grande échelle. D’autres pathogènes atypiques sont ciblés par des tests de PCR avec utilisation d’amorces spécifiques. Nous avons également inclus la culture, la co-culture d’amibes, la détection sérologique d'anticorps dirigés contre des agents sélectionnés et des tests d'antigène urinaire, afin de comparer ces tests de routine aux approches moléculaires. Comme résultats, les tests moléculaires nous ont permis d’identifier un vaste répertoire de 160 espèces bactériennes dont 73 n'ont jamais été précédemment rapportées à l’étiologie des pneumopathies. En outre, nous avons trouvé 37 phylotypes bactériens potentiellement nouveaux. Nous avons également identifié 24 espèces de champignons dont 6 n'ont pas été précédemment rapportées à l’étiologie des pneumopathies, 7 virus et étonnamment 6 espèces de plantes. De plus, certains agents pathogènes considérés comme typiques aux pneumopathies nosocomiales tels que Pseudomonas aeruginosa et des Streptococci ont été détectés chez les contrôles comme chez les patients. Cet étonnant résultat souligne l'existence d'un noyau de microbiote pulmonaire.Dans un deuxième travail, faisant suite aux travaux effectués dans notre laboratoire et qui ont pu mettre en évidence que 19% des pneumopathies nosocomiales étaient déterminées par des microorganismes associés aux amibes (MAAs) de l’eau préalablement ignorés ou négligés, nous avons utilisé un test d'immunofluorescence multiplexe pour tester la prévalence des anticorps contre les MAAs dans le sang de patients admis en réanimation et atteints de pneumopathies et la comparer à la prévalence au moment de l'admission. Comme résultat, nous démontrons que certains MAAs peuvent être plus fréquemment détectés après des épisodes de pneumopathies nosocomiales que lors de l’admission. En outre, la réponse immunitaire aux MAAs semble augmenter lorsque le séjour en réanimation est prolongé. Enfin, nous avons mis au point une stratégie de metagénomique pour tester les prélévements pour lesquels aucune étiologie n’a été retrouvée. [...]Recently, bacterial microbiota from a limited number of patients with cystic fibrosis and ventilator-associated pneumonia (VAP) was studied using 16S rDNA gene amplification followed by clone libraries construction and sequencing. These studies have showed that the microbial population of patients with respiratory infections was more diverse than expected. In the current study, we use a similar approach to identify exhaustively the pathogens (bacteria, viruses, and fungi) comprising the microbiota associated with episodes of pneumonia developed in the intensive care units (ICU). Our study included patients admitted to ICUswith with episodes of ventilator-associated pneumonia (n = 106), community-acquired pneumonia (n = 32), nosocomial pneumonia without mechanical ventilation (n = 22) and aspiration pneumonia (n = 25). A cohort of 25 patients admitted to ICUs without symptoms of pneumonia were studied as controls. This first part of the work enables to prepare an exhaustive repertoire of nosocomial pneumonia pathogenes; to know the prevalence of the pathogens identified and to identify co-infections frequently observed, and especially to ascertain whether these agents can be identified or not in the respiratory samples of patients without symptoms of pneumonia. To perform this part of work, series of samples, including bronchoalveolar lavage (BAL) samples, blood samples and urine samples were collected. These samples were tested by means of modern molecular tools based on the amplification of conserved genes (bacterial 16S rDNA and fungal 18S rDNA genes), followed by highthroutput cloning and sequencing. The atypical pathogens are targeted by PCR tests using specific primers and probes. We also included culture, amoeba co-culture, serological detection of antibodies against selected agents and urinary antigen testing, to compare these routine tests to molecular approaches. Based on molecular testing, we identified a wide repertoire of 160 bacterial species of which 73 were never previously reported in pneumonia samples. Moreover, we found 37 putative new bacterial phylotypes. We also identified 24 fungal species of which 6 have not been previously reported in pneumonia, 7 viruses and surprisingly 6 plant species. Some pathogens considered being typical for ICU pneumonia such as Pseudomonas aeruginosa and Streptococcus species may be detected as commonly in controls as in pneumonia patients which strikingly highlight the existence of a core of pulmonary microbiota.In a second work, following previous works performed in our laboratory which were able to show that 19% of nosocomial pneumonia were determined by micro-organisms associated to amoebae (AAMs) previously ignored or neglected, we used a recent test based on multiplex serology to test for the prevalence of antibodies against the AAMs in the blood of patients admitted to ICU and developed episodes of pneumonia and compare it to the prevalence at the time of admission (controls). As a result, we demonstrate that some AAMs may be more frequently detected after episodes of nosocomial pneumonia than at the admission. In addition, the immune response to AAMS appears to increase when the ICU stay is prolonged.Finally, in order to explore samples for which no microbial aetiology was found, we have developed a subtractive hybridization metagenomic strategy and tested it on different clinical samples. The sensitivity of this strategy was also evaluated. We have demonstrated that our method, based on the detection of DNA and RNA of microorganisms in a single test, allows sensitive detection of different types of microorganisms