Digestate valorization for bioremediation of petroleum hydrocarbons contaminated soils

Maaöljyllä saastuneet maaperät muodostavat ympäristöongelman, joka voidaan ratkaista biologisen kunnostamisen avulla. Maaperän bioaugmentatio öljyä hajottavien bakteerien kanssa on tehokas puhdistusstrategia. Nykyisin tieteellinen kiinnostus kohdistuu sellaisiin bakteerilähteisiin, jotka kykenevät hajottamaan hiilivetyjä, jotka toimivat lajien yhdistelminä rikastukseen siirrostuksen valmistuksen aikana. Bioaugmentointikäsittelyt ovat erityisen tärkeitä maaperässä, jossa orgaanisen aineen pitoisuus on alhainen ja bakteerien määrä alhainen (esim. Intensiivisen kemiallisen käsittelyn jälkeen). Digestaatti on orgaanisen sivutuotteena biokaasun tuotannossa anaerobisten pilkkomisprosessien kautta, ja sillä on suuri mahdollisuus maaperän lannoitteena tiivistettyjen ravintoaineiden takia. Digestaatin mikrobiyhteisön potentiaalia ei kuitenkaan koskaan tutkittu hiilivetyjen hajoamisen suhteen. Tässä opinnäytetyössä tutkittiin digestaattia mikrobisena kylvönä kosteiden öljyhiilivetyjen saastuneiden maaperien bioremediaatiossa. Tavoitteemme olivat: i) tarkistaa dieselöljyä hajottavien bakteerien esiintyminen mädätysrikasteissa ja vertailla dieselöljyn hajoamispotentiaalia öljysaastuneiden maaperäisten rikastusteiden kanssa, ii) tarkistaa digestaatin levityksen vaikutus maaperän mikrobiyhteisöön ja mikrobitoimintaan, iii) tutkia läsnäoloa funktionaalisten geenien, jotka vastaavat hiilivetyjen hajoamisesta (alkB-geenit) mädätteessä ja muunnellussa maaperässä. Ensimmäisen kokeen aikana kehitettiin seitsemän mikrobirikastetta erilaisista ruuansulatuksista, maaöljyllä saastuneesta maaperästä ja maaperän sekoituksesta digestaatin kanssa. Kolmen viikon inkubaation jälkeen korkein dieselöljypoisto havaittiin rikastuksista, jotka olivat peräisin kompostoidusta digestaatista ja öljysaastuneesta maaperästä (vastaavasti 78% ja 77% dieselöljystä). Rikasteilla, jotka on saatu maaperästä sekoitetusta mäntäaineesta, on huonompi suorituskyky kuin yhden lähteen rikastuksilla. Kaikissa rikastuksissa alkB-geenien läsnäoloa edistettiin inkubaation aikana. Toisessa kokeessa suoritettiin 6 erilaista käsittelyä mikrokosmossa käyttämällä kahta teollisuusöljysaastuttamaa maaperää, jolla oli erilaiset rakenteet: savirikas maa ja hiekkamaa. 30 päivän inkubaation jälkeen havaittiin suurin öljyhiilivetyjen poistuminen mikrokosmoissa, jotka sisälsivät: digestaattia yhdessä täyteaineen kanssa (vastaavasti 17,8% ja 12,7% korkeampi kuin kontrolli savenrikkaassa ja hiekkaisessa maaperässä) tai; mädätys yhdessä immobilisoitujen bakteerien kanssa (vastaavasti 13,4% ja 9% korkeampi kuin kontrolli savelirikkaassa ja hiekkaisessa maaperässä). Erilliset mikrobiryhmät muodostuivat muutetussa ja muuntamattomassa maaperässä. Sukuja, jotka sisälsivät lajeja, jotka kykenevät hajottamaan hiilivetyjä, kuten Acinetobacter ja Mycobacterium, oli runsaasti ruuansulatuksessa ja maaperässä, joka muutettiin digestaatilla. AlkB-geenien korkea konsentraatio havaittiin mädätysastiassa, maaperän levityksen jälkeen alkB-geenien taso nousi merkittävästi maaperässä ja pysyi korkeana yhden kuukauden käsittelyn aikana. Kolmannessa kokeessa saastunutta maata inkuboitiin digestaatin ja täyteaineen kanssa bioreaktorissa aktiivisella ilmastolla. Alkuperäinen alkB-konsentraatio oli 1,5% saastuneessa maaperässä ja 4,5% digestaatissa. Maaperän inkubaation aikana mädätteen kanssa alkB-prosenttimäärä nousi 11,5%:iin ja lisäinokulaation jälkeen immobilisoiduilla bakteereilla tämä arvo nousi jopa 60%:iin (alkB-prosenttiosuus mineraaliravinteiden käsittelyssä oli 0,4%). Digestaatin lisääminen vaikutti positiivisesti maaperän hengitykseen ja bakteerien tiheyteen, mikä oli samanaikainen hiilivetyjen lisääntyneen hajoamisen kanssa. Maaperän inkubaatio digestaatilla 2 kuukautta johti 74% hiilivetyjen poistoon, kun taas immobilisoitujen bakteerien lisäys lisäsi tämän arvon 95%:iin. Digestaatti lisäsi maaperän bakteeritiheyttä ja hiilivetyjen monimuotoisuutta hajottavien taksonien suhteen. Tämän opinnäytetyön aikana saadut tulokset vahvistavat, että digestaatti on hyvä hiilivetyä hajottavien bakteerien lähde ja paljastaa sen suuren potentiaalin lisätä alkB-geenien määrää, jotka vastaavat hiilivetyjen hajoamisesta maaperässä bioremedikaation aikana.Petroleum contaminated soils constitute an environmental issue which may be solved with the help of bioremediation. Soil bioaugmentation with petroleum degrading microorganisms is an efficient clean-up strategy. Currently scientific interest is focused on searching new sources of microorganisms able to degrade hydrocarbons which serve as species pools for enrichments during inoculum preparation. Bioaugmentation strategy are especially important in soils with low level of organic matter and low microbial counts (e.g. after intensive chemical treatments). No studies were performed up to date while considering the potential of organic fertilizers and amendments as a microbial seeding source for bioremediation. In this thesis, for the first time, digestate as an example of organic amendment, was studied in terms of indigenous microbial community which can be involved in degradation of linear hydrocarbons. Digestate is an organic by-product of biogas production via anaerobic digestion processes and has a great potential as soil fertilizer due to concentrated nutrients and low content of easily biodegradable compounds (which could be used by bacteria as a preferential carbon source over hydrocarbons). However, the potential of microbial community of digestate was never studied in terms of petroleum hydrocarbons (PHCs) degradation. In this thesis, digestate was examined as microbial seeding for bioremediation of weathered petroleum hydrocarbon contaminated soils. The goals were : I) to check the presence of alkanes degrading bacteria in digestate enrichments and compare alkanes degradation potential with enrichments from petroleum contaminated soils, ii) verify the effect of digestate application on soil microbial community and microbial activity, iii) study the presence of functional genes responsible for alkanes degradation (alkB genes) in digestate and amended soils. During the first experiment, 7 microbial enrichments were developed from various digestates (including composted digestate), a petroleum contaminated soil and from mix of soil with digestate. After 3 weeks of incubation the highest diesel fuel removal was observed for enrichments originating from composted digestate and from the petroleum contaminated soil (78 and 77 % diesel fuel removal, respectively). Enrichments obtained from digestate mixed with soil displayed lower performance than single source enrichments. In all enrichments, presence of alkB genes was promoted during the incubation. The experiment revealed the presence of alkB genes in bacteria from digestate and confirmed their ability to degrade diesel fuel. In a second experiment, 6 different treatments were performed in microcosm using two industrial petroleum contaminated soils having different textures: a clay rich soil and a sandy soil. After 30 days of incubation, the highest petroleum hydrocarbons removal was observed in microcosms containing: digestate together with bulking agent (17.8 % and 12.7 % higher than control in clay rich soil and sandy soil, respectively) or; digestate together with immobilized bacteria (13.4 % and 9 % higher than control in clay rich soil and sandy soil, respectively). Distinct microbial groups were formed in amended and non-amended soils. Genera containing species able to degrade hydrocarbons like Acinetobacter and Mycobacterium were abundant in digestate and soil amended with digestate. The study proved that digestate contains high concentration of alkB genes, significantly higher than contaminated soils. Application of digestate significantly increased the level of alkB genes in soils which remained high during the treatment. In a third experiment, a contaminated soil was incubated with digestate and bulking agent (used to increase porosity of soil mixture and facilitate air transfer) in bioreactors with active aeration. Initial alkB concentration was 1.5 % in contaminated soil and 4.5 % in digestate. During incubation of soil with digestate, alkB percentage increased up to 11.5 % and after additional inoculation with immobilized bacteria this value increased up to 60 % (alkB percentage for treatment with mineral nutrients reached 0.4 %). Addition of digestate positively affected soil respiration and bacterial density, which was concomitant with enhanced hydrocarbons degradation. Incubation of soil with digestate for 2 months resulted in 74 % of hydrocarbons removal, while extra addition of immobilized bacteria increased this value to 95 %. Digestate increased soil bacterial density and diversity of hydrocarbons degrading taxa. The experiment clearly revealed the advantage of digestate over mineral fertilizer due to soil enrichment in TPH degrading taxa and thus a more efficient bioremediation. This thesis for the first time analysed the potential of indigenous bacteria from organic nutrient source in bioremediation. The obtained results proved that digestate is a good source of bacteria caring alkB genes curtail in alkanes metabolism. Moreover, observed population of bacterial caring alkB genes was significantly greater in digestate comparing to contaminated soils. Application of digestate allowed to increase microbial activity and maintain high content of alkB genes in the soil which enhanced PHCs degradation. Experiments performed during the thesis are contributing for better understanding of bioremediation process with the use of organic amendment as a nutrient source. Presented advantages of digestate over mineral fertilizers were evaluated and confirmed. This thesis for the first time proposes organic amendment, like digestate to be considered not only as a nutrient source but also as a valuable source of microorganisms for soil bioaugmentation/biostimulation. Developed experimental treatments are a good starting point for further assessment of digestate during field scale treatments, however detailed risk assessment analysis including effect of potential pathogens contained in digestate on human health and studies analysing the effect of digestate leachates on groundwater quality need to be performed