Search for biologically active compounds in AndoSanTM, a medicinal mushroom extract

Holdes konfidensiell i 1 år grunnet potensiell patentsøknadEnglish: AndoSanTM is a commercial product currently being subject to research for its ability to repress multiple myeloma, colorectal cancer and inflammatory bowel disease. The product is a fermented aqueous extract of three medicinal mushrooms, where Agaricus blazei Murill (AbM) is the main component. Several papers describe the biological effects of AbM and claim that they are caused by fungal β-glucans and proteoglycans, but the exact elucidation of which chemical compounds are responsible for this biological effect is mainly unresolved. Another complicating factor arises with the fact that different parts of the mushroom used in research produce dissimilar extracts and thus makes it difficult to use published literature to state what components AndoSanTM consists of. The aims of this thesis has therefore been to fractionate this product, test the fractions in a biological system using RAW264.7 cells and initiate the process of identifying biologically active compounds. The bioassay uses legumain, a cysteine protease, to monitor activity. Reduced activity is considered beneficial, due to legumain being overexpressed in several solid tumours. AndoSanTM was divided into five crude fractions based on solubility in different solvents (dichloromethane-, methanol-, ethanol- and ethanol soluble and insoluble water extracts), which were roughly characterized by 1H NMR, SDS-PAGE, TLC, UV absorption and carbohydrate analyses. The carbohydrate analyses showed that AndoSanTM contains only about 2 % carbohydrate, which is contradictory to what has been stated for pure AbM mushroom (pure mushroom powder contains approximately 90 % carbohydrate). This also indicates that the biological effects of AndoSanTM cannot solely be attributed to β-glucans. 1H NMR was used to state which groups of chemical compounds the different extracts consisted of. The results indicated different compositions of the different extracts, of which the composition of the two alcohol extracts and the two water extracts resembled each other. All extracts contains a mixture of several groups of compounds, and thus further purifications are necessary to provide more detailed descriptions. TLC indicated highly polar components in the water extracts, and SDS-PAGE detected protein in the ethanol insoluble water extract (EIW). The extracts of AndoSanTM were screened for inhibition of legumain activity in RAW264.7 cells, of which the EIW exhibited the greatest inhibitory activity. Pure AndoSanTM powder and EIW were also screened for their inhibition autoactivation of prolegumain. Results showed that AndoSanTM and EIW are very potent inhibitors of the autoactivation of prolegumain (approximately 80 % inhibition at concentrations above 1 mg/mL), of which EIW seems to have somewhat higher potency than unfractionated AndoSanTM powder. In addition, pure AndoSanTM powder was incubated with active legumain, which resulted in 40 % enzyme inhibition at concentrations above 0.5 mg/mL. EIW was chosen for further purification, and was separated into two fractions by SEC; EIW-A and EIW-B, of which EIW-A exhibited the greatest reduction of legumain activity in RAW264.7 cells. However, the inhibitory activity of EIW-A was not better than that of crude EIW, indicating synergistic or combined effects of the compounds in EIW. In addition to the characterisation analyses performed with the crude extracts, EIW-A and EIW-B were also analysed by LC-MS and GC-MS. The former was performed with both extracts to attempt to identify any constituents, whereas the latter was done to determine the binding pattern of the polysaccharides in EIW-A. LC-MS did not result in identification of any compounds, but indicates highly polar components and the presence of a sodium salt in both fractions. EIW-A proved to be the fraction with most carbohydrate (10 %), which would contain potential β-glucans and other high Mw polysaccharides. In contrast, EIW-B contains only 0.4 % carbohydrate. The binding pattern analysis of carbohydrates in EIW-A implied only traces of 1,3 bound glucose monomers, which is another indicator of low β-glucan content in AndoSanTM. In conclusion, further purification of AndoSanTM compounds is necessary for identification of specific bioactive agents. In regard to legumain activity it is apparent that EIW is the most interesting choice for further studies, but synergistic and/or combined effects of constituents can complicate the work of identifying a single active component. Norsk: AndoSanTM er et kommersielt produkt som for øyeblikket er gjenstand for forskning for bruk mot multippelt myelom, tarmkreft og Crohn’s sykdom. Produktet er et fermentert vandig ekstrakt av tre ulike medisinske sopper, hvor Agaricus blazei Murill (AbM) er hovedbestanddelen. Mange vitenskapelige artikler beskriver de biologiske effektene av AbM og mange påstår også at disse effektene er forårsaket av β-glukaner og proteoglykaner, men en avklaring i nøyaktig hvilke komponenter som gir de observerte effektene er enda ikke fastslått. En kompliserende faktor oppstår når forskningsresultater stammer fra ulike fragmenter av soppen, hvilket kan resultere i svært ulike ekstrakter av samme soppart. Dette gjør det vanskeligere å bruke publiserte data til å fastslå hva AndoSanTM kan bestå av. Målene med denne oppgaven har derfor vært å fraksjonere dette produktet, å undersøke biologisk aktivitet i et cellesystem bestående av en makrofagcellelinje (RAW264.7) samt å innlede prosessen med å identifisere komponenter i AndoSanTM. Det biologiske testsystemet bruker legumain, en cysteine protease, til å måle aktivitet. Redusert legumainaktivitet anses som fordelaktig, ettersom uttrykk av legumain er økt i flere typer kreftsvulster. AndoSanTM ble delt opp i fem fraksjoner på bakgrunn av ulik løselighet i ulike løsemidler. Disse ble grovt karakterisert med 1H NMR, SDS-PAGE, UV absorbans, tynnsjiktskromatografi (TLC) og karbohydratanalyser. Sistnevnte analyser påviste et karbohydratinnhold i AndoSanTM på kun 2 %, noe som strider imot det som har blitt funnet for rent, pulverisert soppmateriale (består av 90 % karbohydrat). Dette antyder også at de biologiske effektene av AndoSanTM ikke kan være forårsaket av β-glukaner alene. 1H NMR ble brukt for å si noe om hvilke grupper av komponenter som var tilstede i ekstraktene, og spektrene antydet ulike grupper av komponenter i ulike ekstrakter. De ekstraktene som ble ekstrahert med liknende kjemikalier lignet hverandre (de to alkoholekstraktene samt de to vannekstraktene ga veldig like spektra). TLC av vannekstraktene antydet svært polare bestanddeler og SDS-PAGE påviste protein i det etanoluløselige vannekstraktet. AndoSanTM ekstraktene ble også screenet for inhibering av legumainaktivitet i RAW264.7 celler, hvorav det etanoluløselige vannekstraktet (EIW) viste høyest inhiberende aktivitet. Rent AndoSanTM pulver ble deretter inkubert med aktivt legumain og autoaktivert prolegumain for å kunne si noe om denne hemmingen i aktivitet skyldes direkte hemming av aktivt enzym, eller om den skyldes hemming av autoaktiveringen av prolegumain ved pH 4. EIW ble også inkubert med autoaktivert enzym for å undersøke om det ga mer hemming enn ubehandlet AndoSanTM. Resultatene viser at AndoSanTM og EIW er svært potente inhibitorer av autoaktivering av prolegumain, hvorav EIW viser bedre inhibering ved konsentrasjoner 0.25 og 0.5 mg/mL. Ved konsentrasjoner på 1 mg/mL og oppover gir begge ekstraktene like god hemming av autoaktivering (ca. 80 %). Resultater viser også at AndoSanTM hemmer aktivt enzym, men ikke i like stor grad som det hemmer autoaktivering (ca. 40 % hemming ved konsentrasjoner over 0.5 mg/mL). Det etanoluløselige vannekstraktet ble, på bakgrunn bedre hemming av legumainaktivitet i RAW264.7 celler, valgt for videre opprensing og karakterisering. Ekstraktet ble separert i to fraksjoner vha. SEC; EIW-A og EIW-B, hvorav EIW-A viste best inhibering av legumain i celleforsøk. EIW-A viste ikke bedre hemming enn EIW, hvilket antyder synergi og/eller kombinerte effekter av komponentene i EIW. I tillegg til karakteriseringsanalysene utført på råekstraktene, ble EIW-A og EIW-B også analysert med LC-MS og GC-MS. Førstnevnte ble utført på både EIW-A og EIW-B for å forsøke å identifisere komponenter i disse, mens sistnevnte ble utført for å bestemme bindingsmønsteret til polysakkaridene i EIW-A. LC-MS førte ikke til identifikasjon av spesifikke komponenter, men antyder polare bestanddeler samt påviste en lavmolekylær natriumkomponent (antakelig et natriumsalt) i både EIW-A og EIW-B. EIW-A er den fraksjonen som viste seg å inneholde mest karbohydrat (10 %), og vil også inneholde eventuelle β-glukaner. I motsetning til EIW-A inneholder EIW-B kun 0.4 % karbohydrat. Analyse av bindingsmønsteret til polysakkaridene i EIW-A antydet at ekstraktet inneholder kun små mengder 1,3 bundet glukose, hvilket indikerer lavt innhold av β-glukaner. Det konkluderes med at videre opprensing av AndoSanTM fraksjoner er nødvendig for å identifisere enkeltkomponenter som har en spesifikk biologisk effekt, og at eventuelle β-glukaner alene ikke kan forklare de biologiske effektene av AndoSanTM. Med hensyn til legumainaktivitet er det tydelig at EIW er mest interessant, men synergi mellom de ulike komponentene i produktet kan vanskeliggjøre identifikasjonen av en enkelt forbindelse som gir fordelaktig effekt