En studie av sensitivitet og toleranse for kronisk gammabestråling hos nematoden Caenorhabditis elegans

At the cellular level, excitation and ionization of atoms and molecules constitute the fundamental processes leading to harmful effects induced by exposure to ionizing radiation. However, radiosensitivity, defined as the relative susceptibility of organisms, tissues or cells to the harmful effects of ionizing radiation, differs considerably across species and phyla. Specifically, a lethal dose for most vertebrates (10 Gy) is orders of magnitude lower than the dose required to induce detrimental effects in the utmost radioresistant species (≤1.2 kGy). Living organisms can be exposed to ionizing radiation in the environment due to nuclear accidents, but also due to the routine release from nuclear power plants or reprocessing plants. This can result in chronic exposure at doses above the background levels, with adverse consequences for the population dynamics and sustainability, because sensitive life-stages or vulnerable biological processes are impaired. Importantly, while most of the research on radioresistant species has focused on acute exposure to high doses, the effects of chronic exposure to low doses remained under appreciated. A ground-breaking study by Buisset-Goussen et al. (2014) revealed that chronic gamma irradiation caused significant reprotoxic effects from relatively low total doses in the radioresistant nematode Caenorhabditis elegans. However, the molecular mechanisms causing this adverse effect needed a better understanding. The current PhD study focused on the investigation of cellular and molecular mechanisms behind the phenotypical adverse effects shown in the nematode C. elegans after chronic exposure to ionizing radiation. In particular, the different experiments were designed in order to gain more information about the dose-response reprotoxic and developmental effects, the larval-stage sensitivity as well as the cell and tissue-specific sensitivity. For this purpose, a range of low and high dose-rates of gamma radiation from a 60Co source was selected (0.4 to 1000 mGy·h-1) and a multitude of cellular and molecular biology techniques applied, including the use of GFP reporter strains, epifluorescence microscopy and RNA sequencing. Moreover, this study involved the development and optimization of new methods, including the embryonic cells isolation in order to assess DNA damage via the Comet assay or the droplet digital PCR method, optimized to measure the mitochondrial DNA (mtDNA) copy number variation. The results demonstrate that chronic exposure during larval development induces reprotoxic effects at doses ≥3.9 Gy (40 mGy·h-1), while acute or chronic irradiation during the post-mitotic larval stage does not induce any adverse effect at doses ≤15 Gy (≤1 Gy·h-1). L1-L4 larval stages were shown to be the most radiosensitive stages of development due to impaired spermatogenesis. Specifically, significant sperm reduction and dysregulation of genes related to sperm meiosis and maturation were identified as the cause of reprotoxicity. At the mechanistic level, these results provide important insight into the radiation induced cellular processes that lead to failed spermatogenesis. These mechanisms may be relevant to other species given the conserved nature of meiosis and the fact that radiation is known to damage spermatogenesis in earthworms, insects, mice, as well as humans. Adverse effects on proliferative cells were also shown by enhanced germ cell apoptosis in F0 nematodes and significant DNA damage in embryos (F1) of irradiated nematodes, which was corroborated by the dysregulation of genes related to cell-cycle checkpoints, DNA repair, embryonic and post-embryonic development. In contrast to their parents, negative effects on somatic growth but no significant reprotoxic effects were observed in F1 parentally irradiated nematodes. Suggesting that, parental exposure to ionizing radiation induces the activation of defence mechanisms. These aid to ameliorate the severe DNA damage, under control conditions, but may require high energy cost which might explain their significantly reduced somatic growth. The increased ROS levels together with the enhanced AODs activation was demonstrated in vivo and by gene expression analysis after chronic irradiation of F0 nematodes. This was not accompanied by any adverse effect on somatic cell viability or any visible phenotypical effect, indicating tolerance of somatic tissue, despite the cellular redox imbalance. However, the observed redox imbalance suggested a significant contribution of indirect effects, including oxidative damage to DNA, proteins, lipid metabolism and mitochondrial functions from chronic exposure to ionizing radiation. In particular, genes essential for the assembly and proper functioning of the mitochondrial electron transport chain were found significantly down-regulated. For this reason, mitochondria were proposed as a vulnerable target of chronic irradiation. However, by measuring the mt/nDNA-ratio (mitochondrial/nuclear DNA) as read-out for mitochondrial dysfunction, at doses of exposure ≤7.2 Gy, nematodes showed to maintain a stable mtGenome content. Only doses ≥24 Gy demonstrated a significant increase in the mtDNA copy number, suggesting a potential role of mtDNA replication and maintenance in the intrinsic radioresistance of C. elegans somatic cells. Taken together the main findings of this research contributed to an improved understanding of the molecular and cellular mechanisms of toxicity and tolerance induced after chronic exposure to ionizing radiation in an important model organism, C. elegans. The finding that spermatogenesis in a radioresistant nematode is affected by 2.8 Gy, which is approximately three orders of magnitude lower than the reported acute LD90 (lethal dose required to kill 90% of the tested population), demonstrates the importance of characterizing effects of chronic low dose and low dose-rate of ionizing radiation. This information may also be relevant for further comparative analysis with other species, expressing different degrees of sensitivity, as well as for multi or trans-generational studies performed on the same model organism.Ioniserende stråling forårsaker skadelige effekter i alle typer celler via to fundamentale prosesser: eksitasjon eller ionisering av atomer og molekyler. Strålingssensitivitet er definert som den relative følsomheten av organismer, vev eller celler overfor skadelige effekter av ioniserende stråling, er svært forskjellig mellom ulike arter og phyla. En dose på ti Gray (10 Gy) vil forårsake død hos de fleste vertebrater, mens de mest stråleresistente artene må ha over hundre ganger denne dosen (≤1.2 kGy) før de viser tegn til skade. Organismer kan bli eksponert for ioniserende stråling i miljøet som følge av atomulykker eller fra rutineutslipp fra atomkraftverk og nukleære reprosesserings-anlegg. Dette kan gi kronisk eksponering for betydelig høyere doserater sammenlignet med naturlig bakgrunnsstråling. Dette kan i noen tilfeller ha negativ effekt på sensitive livsstadier eller sårbare biologiske prosesser, hvilket kan medføre adverse effekter på populasjondynamikk eller levedyktighet. Forskning på strålingsresistente arter har fokusert på akutt eksponering ved høye doser. Effekter av lavdose kronisk eksponering har til sammenligning vært lite vektlagt inntil en gjennombruddstudie (Buisset-Goussen et al., 2014) viste signifikante reproduksjonsdefekter hos den strålingsresistente nematoden Caenorhabditis elegans. De underliggende molekylære mekanismene som forårsaket slike adverse effektene var ikke kjent. Denne PhD-studien har fokusert på cellulære og molekylære mekanismer knyttet til fenotypiske adverse effekter av kronisk eksponering til ioniserende stråling i nematoden C. elegans. Studien ble designet for å få innsikt i dose-respons sammenhenger i reprotoksisitet, utviklingsdefekter, sensitive celletyper og livsstadier. Denne studien har derfor omfattet et spenn fra lave til høye doserater (0.4 til 1000 mGy·h-1), kombinert med en rekke cellulære, molekylære teknikker, inkludert GFP-reporterstammer, epifluorescens-mikroskopi og RNA-sekvensering. Det har også vært nødvendig å utvikle og optimalisere nye metoder inkludert isolering av embryoceller for å kunne måle DNA-skade via COMET, og kvantitativ måling av mitokondrie DNA (mtDNA) kopitall via ‘digital dråpe basert PCR’ (ddPCR). Resultatene viste at kronisk eksponering gjennom larveutviklingen induserer reprotoksiske effekter ved ≥3.8 Gy (≥40 mGy·h-1), mens akutt eller kronisk bestråling av post-mitotiske larver hadde ingen detekterbare effekter ≤15 Gy (≤1000 mGy·h-1). L1-L4 stadiene ble vist å være det mest strålingssenitive delen av nematodens utvikling pga defekt spermatogenese. Signifikant redusert spermproduksjon og dysregulering av gener involvert i sperm-meiose og modning ble identifisert som årsak til reprotoksisitet. Disse resultatene er viktig og gir ny innsikt i strålingsinduserte cellulære effekter som skader spermatogenesen. Disse mekanismene kan være relevante for andre arter pga mange prosesser i sperm-meiosen er konservert, og fordi stråling er vist å skade spermatogenese i meitemark, insekter, mus og mennesker. Adverse effekter ble påvist i prolifererende celler, både ved økt apoptose i kjønnsceller i F0 nematoder, og ved signifikant DNA skade i F1 embryo av bestrålte nematoder. Disse effektene ble underbygget av dysregulering av gener involvert i cellesyklus sjekkpunkter, DNA-reparasjon, samt embryo og post-embryo utvikling. I motsetning til den bestrålte foreldregenerasjonen (F0), viste avkom (F1) signifikant redusert vekst men ingen reprotoksisitet. Dette kan tyde på en sterk aktivering av forsvarsmekanismer, f.eks DNA-reparasjon, men at disse har en kostnad i form av høyere energiforbruk og redusert vekst. Økt produksjon av reaktive oksygenforbindelser (ROS) og aktivering av antioksidant forsvar (AOD) i kronisk bestrålte nematoder, ble vist in vivo og ved genekspresjonsanalyser. Til tross for signifikant redoks ubalanse ble det ikke observert fenotypiske endringer eller redusert viabilitet i somatiske celler. Den observerte redoks-ubalansen viser et signifikant potensiale for indirekte effekter og oksidative skader på DNA, protein, lipidmetabolisme og mitokondriefunksjon ved kronisk eksponering til ioniserende stråling. Genekspresjonsanalyser viste at gener med essensiell funksjon i elektrontransportkjeden var signifikant nedregulerte, og indikerte at mitokondriefunksjoner kunne være sensitive for ioniserende stråling. Dette ble videre undersøkt ved å bruke mitokondriell/nukleær (mt/n) DNA-ratio som endepunkt for å vurdere mitokondriell dysfunksjon. Resultatene viste ingen effekt på mtDNA kopitall ved doser ≤7.2 Gy. Doser ≥24 Gy førte derimot til en dobling i mtDNA kopitall, hvilket kan tyde på at mitokondrie DNA blir replisert, og vedlikeholds mekanismer bidrar til strålingsresistensen i C. elegans somatiske celler. Samlet sett har hovedfunnene av denne studien bidratt til økt kunnskap om molekylære og cellulære mekanismer knyttet til toksisitet og toleranse hos en viktig modellorganisme, C. elegans ved kronisk eksponering til ioniserende stråling. Funnet av inhibert spermatogenese ved 2.8 Gy i en stråleresistent organisme, noe som er ca 1000 ganger lavere enn akutt LD90 (akutt dose med 90% dødelighet), viser viktigheten av å studere effekter av kronisk lav dose og doserate ioniserende stråling. Disse funnene er relevante for komparative analyser med andre arter med ulik strålingsensitivitet, og danner et fundament for fremtidige studier av multi- eller transgenerasjonelle strålingseffekter i C. elegans