Aldehyde dehydrogenasa tjáning, hvarfgjörn súrefnissambönd og stofnfrumueiginleiki eftir doxorubicin meðhöndlun brjóstaþekjufruma

Aldehyde dehydrogenases (ALDH) are a group of enzymes suggested to be highly expressed in both normal and cancer stem cells. Normal cells use the enzymes mainly to catalyze the oxidation of harmful aldehydes from various precursors to carboxyl acids. Cancer cells may require ALDH activity for metabolism of therapeutic drugs and development of drug resistance. The cell lines D492, D492M and D492HER2 were used in the current study. D492 is a breast epithelial cell line with stem/progenitor cell properties. It generates both luminal and myoepithelial cells and forms branching colonies in 3D culture similar to breast epithelium in vivo. D492M is a sub-line of D492 that has adapted a mesenchymal character through epithelial-mesenchymal transition (EMT). D492HER2 is also a sub-line with overexpression of the oncogene HER2 and has undergone EMT. These pre-neoplastic cells show increased proliferation, stem cell properties and are tumorigenic when injected to NOD/SCID mice. The cell lines received eight cycles of low dose (30 ng/ml) doxorubicin (DXR) treatment. The responses towards the treatment in relations to stem cell properties, ALDH activity, ROS levels, proliferation, epithelial- and mesenchymal marker expression and apoptosis were evaluated. D492 and D492HER2 both seemed to show increased stem cell properties after DXR treatment. The immediate response of D492 to treatment was increased ALDH activity and ROS levels that diminished as treatments and passages increased. Results indicated that other pathways or other undetected isoforms seemed to take over as measured ALDH activity decreased with continuous DXR treatments. D492HER2 first showed increased ROS levels which decreased after additional DXR treatments, indicating a selection for cells with less stress response to treatment than after initial treatments. ROS levels of D492HER2 were greatly reduced compared to the other cell lines, indicating increased ROS scavenging abilities of D492HER2 or a lower ROS baseline. Some results indicated that D492HER2 showed plasticity between EMT to MET-like states with re-establishment of cytokeratin expression. No conclusion could be made for D492M other than it seemed to adapt an epithelial phenotype which could be due to DXR treatment or a random phenotype switch accompanying high passage number. All cell lines showed increased proliferation between cycles five and eight of DXR treatment, which could be explained by selection of fast proliferation cells due to the treatments or just natural selection that occurs with every passage. A combination of both factors is also possible. The next step of the ongoing study is to sequence the mRNA of D492 and D492HER2, untreated and treated cells in order to evaluate the ALDH isoforms and other pathways which contribute to DXR response, potential resistance and increased stem cell properties.Aldehyde dehydrogenasar (ALDH) eru hópur ensíma tjáð bæði í eðlilegum vefja- og krabbameinsstofnfrumum. Eðlilegar frumur nýta sér ALDH virknina til verndar gegn skaðlegum áhrifum aldehýða en krabbameinsfrumurnar mögulega til niðurbrots á krabbameinslyfjum og þróun á lyfjaónæmi. Frumulínurnar D492, D492M og D492HER2 voru notaðar í þessu verkefni. D492 er brjóstaþekjufrumulína með þekkta stofnfrumueiginleika. Hún myndar bæði kirtilþekju- og vöðvaþekjufrumur ásamt því að mynda þyrpingar af greinóttri kirtillíkri formgerð í þrívíðri rækt. D492M, dótturlína D492, er frumulína sem gengist hefur undir bandvefsumbreytingu þekjuvefjar (EMT) og öðlast bandvefseiginleika. D492HER2 er dótturlína D492 með yfirtjáningu á krabbameinsgeninu HER2 sem hefur að auki gengist undir EMT. D492HER2 sýnir aukna frumufjölgun, aukna stofnfrumueiginleika og er æxlismyndandi þegar henni er sprautað í ónæmisbældar (NOD/SCID) mýs. Frumulínunum var gefið lágskammta (30 ng/ml) meðferð af krabbameinslyfinu doxorubicin (DXR). Viðbrögð við meðferðinni í tengslum við stofnfrumueiginleika, ALDH virkni, hvarfgjörn súrefnissambönd (ROS), frumufjölgun, breytta tjáningu þekjuvefs- og bandvefsmarkera og stýrðan frumudauða voru metin. Frumulínurnar D492 og D492HER2 sýndu báðar mögulega aukna stofnfrumueiginleika eftir DXR meðferð. Í fyrstu sýndi D492 aukna ALDH virkni og ROS sem síðar lækkaði eftir að lyfjaskömmtum og frumukynslóðum fjölgaði. Þær niðurstöður benda til þess að aukin ALDH virkni séu fyrstu viðbrögð frumanna við krabbameinslyfinu. Aðrir ferlar eða önnur ísóform af ALDH virðast síðan taka yfir með aukinni meðferð þar sem ALDH virkni minnkaði. D492HER2 sýndu í fyrstu aukið ROS sem síðan lækkaði með frekari meðferð. Þetta bendir til þess að ákveðið val hafi átt sér stað fyrir frumum sem sýna minni stressviðbrögð gagnvart meðferð miðað við fyrstu meðferðir og ómeðhöndlaðar frumur. D492HER2 virðist hafa betri eiginleika til að vinna úr ROS, þar sem mun minna magn var í þeim frumum miðað við hinar frumulínurnar. Sumar niðurstöður benda til þess að D492HER2 búi yfir eiginleikum til að skipta á milli EMT- og MET-líks ástands. Erfitt er að draga ályktarnir á viðbrögðum D492M við DXR meðferð þar sem frumulínan hafði öðlast á ný þekjuvefssvipgerð sem gæti verið vegna meðferðarinnar eða vegna náttúruvals óháð lyfjameðferð. Allar frumulínurnar sýndu aukna frumufjölgun milli meðferða fimm og átta sem gæti verið útskýrt; með vali á ört fjölgandi frumum sem aðlögun gagnvart DXR lyfinu. Einnig getur hafa átt sér stað náttúrulegt val milli frumukynslóða fyrir frumum með hraðari fjölgun. Næstu skref verkefnisins er að framkvæma heildar mRNA raðgreiningu á D492 og D492HER2, ómeðhöndluðum og DXR meðhöndluðum frumum til þess að meta hvaða ALDH ísóform, þættir og ferlar stuðla að mögulegu lyfjaónæmi og auknum stofnfrumueiginleikum