Tjáning á Aldehyde dehydrogenasa (ALDH) í brjóstastofnfrumulínunni D492 og tengsl við stofnfrumueiginleika

Aldehyde dehydrogenases (ALDH) are enzymes expressed in both normal and cancer stem cells (CSC). CSCs are hypothesized to arise from normal stem cells and acquire a malignant phenotype through series of genetic mutations. Current therapies often fail to eradicate CSCs causing metastatic relapse. Further characterization of mammary stem cells (MaSC) may increase the understanding of normal and cancer stem cells and contribute to identification of novel therapeutic targets in breast cancer. The D492 and D492M cell lines were used in the current study. D492 is a breast epithelial cell line with stem cell properties. It generates both luminal and myoepithelial cells and forms branching colonies in 3D culture similar to structures seen in vivo. D492M is a subline of D492 that has adapted mesenchymal character through epithelial-mesenchymal transition (EMT). EMT is a process where epithelial cells gain a mesenchymal phenotype with increased motility and lose their traditional cell-cell contacts and polar epithelial phenotype. EMT is a process occurring naturally during development and tissue repair but has also been linked to invasiveness and metastasis in cancer. In an attempt to characterize the MaSC subpopulation, various markers were used that have been linked to normal and malignant stem cells with focus on ALDH activity. ALDH are enzymes catalyzing the NAD(P)+ dependent oxidation of aldehydes to carboxyl acids. ALDH activity is evaluated with the Aldefluor assay, where ALDH converts a fluorescence substrate to a product that is contained intracellular and detected by FACS. In this study D492 and D492M were analyzed in terms of ALDH activity and stem cell marker expression. When compared, D492 showed higher ALDH activity than D492M. None of the selected surface stem cell marker turned out useful for the characterization and isolation of the stem cell subpopulation with high ALDH activity. A connection was suggested between ALDH activity and side scatter (SSC) that needs further analysis. Increased passage number did not significantly affect ALDH activity in D492. D492 cells were sorted in FACSAria based on their ALDH activity into fractions containing high, medium and low ALDH levels and seeded in 3D culture (Matrigel) with and without breast endothelial cells (BRENC). Colonies formed earlier from ALDH high cells and had a stronger tendency to form branching structures. According to a western blot, ALDH high cells had increased expression of the stem cell marker Thy-1 compared to ALDH low cells and proliferated faster when seeded at a low density. Results from this preliminary study suggest that high expression of ALDH may predict stem cell properties in D492, however further studies including additional stem cell assays are needed to verify these findings.Aldehyde dehydrogenasar (ALDH) eru ensím tjáð bæði í eðlilegum vefja- og krabbameinsstofnfrumum. Krabbameinsstofnfrumur eru taldar viðhalda krabbameinsæxlum og stýra eiginleikum þeirra. Talið er að þessar frumur séu komnar af eðlilegum vefjastofnfrumum en öðlist illkynja eiginleika vegna uppsöfnunar á stökkbreytingum. Þær viðhalda þó einnig upprunalegu stofnfrumueiginleikunum sínum. Krabbameinsmeðferðir framkvæmdar í dag virðast ekki með nógu afgerandi hætti ráðast að krabbameinsstofnfrumum og er þá hætta á endurkomu sjúkdómsins með myndun nýs æxlis. Aukin þekking á eiginleikum krabbameinsstofnfruma er mikilvæg til að markvisst sé hægt að eyða þeim með meðferð án þess að skaða heilbrigðu frumurnar. Í þessu verkefni voru frumulínurnar D492 og D492M skoðaðir út frá tjáningu yfirborðsprótína (markera) og ALDH ensíma í von um að geta aðgreint stofnfrumur þeirra. D492 er brjóstaþekjufrumulína með þekkta stofnfrumueiginleika. Hún myndar bæði kirtilþekju- og vöðvaþekjufrumur ásamt því að mynda þyrpingar af greinóttri kirtillíkri formgerð í þrívíðri rækt. D492M, dótturlína D492, er frumulína sem gengið hefur undir bandvefsumbreytingu þekjuvefjar (EMT) og öðlast bandvefseiginleika. Við EMT missa frumur vel skipulagða þekjuvefs uppbyggingu sína og taka upp svipgerð bandvefsfruma með aukið frumufar. EMT á sér stað í eðlilegum fósturþroska og vefjaviðgerðum en er einnig tengt við ífarandi krabbamein, aukinn krabbameinsvöxt og meinvörp. Rannsóknir benda til þess að skörun sé á milli EMT og stofnfrumueiginleika og EMT eigi þátt í myndun og viðhaldi krabbameinsstofnfruma. ALDH er ensím sem hvatar oxun aldehyda í karboxýl sýrur. Aldehydar geta haft skaðleg áhrif og er hvarfið þáttur í afeitrun frumunnar. ALDH virkni er talin fylgja stofnfrumueiginleikum í bæði eðlilegum og krabbameinsstofnfrumum. Megináhersla var lögð á ALDH virkni í þessu verkefni. ALDH virkni var mæld með prófi sem byggir á flúrljómandi hvarfefni sem ALDH umbreytir, myndefnið helst síðan innan í frumunni og er greint í frumuflæðisjá. Samanburður á ALDH virkni leiddi í ljós að virknin var marktækt meiri í D492 frumum en D492M. Ræktun fruma hafði ekki marktæk áhrif á ALDH virkni skv. samanburði á mismunandi kynslóðum D492. Yfirborðsprótín sem voru prófuð sýndu yfirleitt einsleita tjáningu og voru ekki gagnleg til að spá fyrir um ADLH virkni í D492 og D492M. D492 frumur voru flokkaðar eftir ALDH virkni og sáð í þrívíða rækt með og án brjóstaæðaþelsfruma. Frumur með háa ALDH tjáningu mynduðu þyrpingar fyrr og virtust þær hafa aukna tilhneigingu til að mynda kirtillíka formgerð en frumur með miðlungs og lága ALDH tjáningu. Þessar frumur höfðu einnig hærri tjáningu á stofnfrumumarkernum Thy-1 og fjölguðu sér hraðar en ALDH lágar frumur þegar þeim var sáð í lágum þéttleika. Niðurstöður þessarar rannsóknar eru vísbendingar um aukna stofnfrumueiginleika D492 fruma með háa ALDH tjáningu og möguleika ALDH sem stofnfrumurmarker. Til þess að staðfesta niðurstöðurnar er þó þörf á frekari rannsóknum sem fela í sér meiri næmni á stofnfrumueiginleika