Development of a novel pancreatic derived organoid culturing system for drug screening purposes

Pancreatic cancer is one of the most fatal malignancies today with the incidence rate being almost the same as mortality rate and treatment success is exceptionally low with 5-year survival around 5-7%. Therefore, it is particularly important to improve and better treatment options with precision cancer medicine and targeted therapy where treatment is individualized to each patient’s needs. Culture of tumor tissue in a 3D microenvironment has given good results in sustaining tumor tissue long term without altering the primary tumor’s characteristics or phenotype. Organoid culture can be used as a platform for drug sensitivity assays in vitro and thus sparing the patient from the toxic effects of chemotherapeutic agents until the most suitable drug has been identified There are however limitations to culturing primary tumor tissue in 3D microenvironment, first there is usually a small starting sample size, and second, some cancer cells, especially post neoadjuvant chemotherapy can have a slow growth rate, increasing the assays time frame. The aim of this project is to establish a method for co-culturing endothelial cells with pancreatic cancer cells in 3D microenvironment to see if the endothelial cells can support cancer cells and increase their proliferation in 3D culture, producing patient derived organoids. Our intentions are to use the organoids for in vitro drug sensitivity assays to increase drug treatment efficacy and as a research model to explore drug resistance mechanisms. For this project, two distinct cell lines were used as an internal reference, CAPAN-1 that carries a BRCA2 mutations and should therefore be sensitive to PARP inhibition, and Mia PaCa-2 which is not. Cell lines were cultured in either 2D monoculture or 3D microenvironment in Cultrex gel with endothelial cells. Cell cultures were treated with Olaparib, a PARP inhibitor and cell viability was evaluated using Celltiter glo chemiluminescence assay. Results show that co-culture of pancreatic cancer cell lines with endothelial cells both supports and increases proliferation in 3D microenvironment and cancer cells hardly grow in low cell densities without endothelial cells. We also demonstrated how Olaparib reduces CAPAN-1 growth while it does not seem to effect Mia PaCa-2, independent of culture condition. Co-culture with endothelial cells seems to reduce drug sensitivity for CAPAN-1 against Olaparib while Mia PaCa-2 is not affected. RT-qPCR results on co-culture conditions indicate an endothelial-induced EMT in CAPAN-1 and Mia PaCa-2, still further testing is necessary for confirmation. To summarize, results of this project indicate that endothelial cells have a positive effect on the growth rate of pancreatic cell lines and should therefore be a suitable addition to pancreatic derived organoid culture.Briskrabbamein er lífshættulegur sjúkdómur þar sem nýgengi er nánast það sama og dánartíðni og 5 ára lifun um 5-7%. Lyfjameðferðir hafa borið takmarkaðan árangur og því áríðandi að bæta og sérsníða meðferðarmögulega ásamt því að finna ný lyf fyrir þennan sjúklingahóp. Ræktun krabbameinsfrumna í þrívíðu hefur tekist vel til og þannig hægt að rækta upp æxlisvef frá sjúklingum við aðstæður þar sem öræxlin viðhalda svipgerð og öðrum eiginleikum upprunaæxlis. Slík ræktunaraðferð bíður upp á að prófa lyfjanæmi öræxla in vitro og þannig hlífa sjúkling við eitrunaráhrifum lyfjameðferð þar til hentugasta lyfið finnst. Uppsetning þrívíðrar frumuræktar úr nálarsýni frá æxlum sjúklinga getur verið takmörkunum háð því fjöldi æxlisfrumna er lágur og vöxtur æxlisfrumna getur verið hægur eftir lyfjameðferð. Þannig getur tímaramma prófsins orðið langur sem kemur sér afar illa fyrir sjúkling með takmarkaða möguleika og sjúkdóm á lokastigi. Markmið verkefnisins er að þróa og setja upp aðferð við ræktun öræxla úr briskrabbameini í þrívíðri frumurækt og kanna hvort æðaþelsfrumur í samrækt styðji við og hraði vexti krabbameinsfrumna. Þá er hægt að nýta öræxlin í in vitro lyfjanæmisprófanir og þannig aukið skilvirkni lyfjameðferða en einnig henta þau vel sem rannsóknarlíkan, t.d. fyrir myndun lyfjaþols æxlisfrumna. Í þessu verkefni var notast við tvær ólíkar frumulínur til að hafa innbyrðis viðmið, CAPAN-1 sem ber BRCA2 stökkbreytingu og því næm fyrir PARP hindra og Mia PaCa-2 sem er ónæm fyrir PARP hindrun. Frumulínur voru ræktaðar ýmist í tvívíðri frumurækt eða þrívíðu umhverfi í Cultrex geli, með eða án æðaþelsfrumum. Frumuræktir voru meðhöndlaðar með PARP hindranum Olaparib og vöxtur frumna mældur með CellTiter Glo efnaljómunarmælingu. Niðurstöður sýna að æðaþelsfrumur styðja við vöxt briskrabbameinsfrumna í þrívíðu umhverfi en briskrabbameinsfrumur vaxa lítið sem ekkert án æðaþels í lágum frumufjölda. Einnig sást að Olaparib dregur úr vexti CAPAN-1 en virðist ekki hafa áhrif á Mia PaCa-2, bæði í tvívíðu og þrívíðu umhverfi. Í samrækt virðast æðaþelsfrumur draga úr lyfjanæmi CAPAN-1 gegn Olaparib en vöxtur Mia PaCa-2 var óbreyttur. Niðurstöður RT-qPCR benda til að samrækt við æðaþelsfrumur ýti undir bandvefsumbreytingu þekjuvefsfrumna (epithelial to mesenhcymal transition, EMT) hjá CAPAN-1 og Mia PaCa-2 en frekari rannsókna er þörf til að staðfesta það. Heilt yfir gefa niðurstöður verkefnisins til kynna að æðaþelsfrumur hafi jákvæð áhrif á vöxt krabbameinsfrumulína með uppruna úr brisi í þrívíðri rækt og því forsenda fyrir að nýta þær við uppsetningu á þrívíðri ræktun öræxla úr brisæxlum.Krabbameinsfélag Íslands, Landspítali Háskólasjúkrahús, Nýsköpunarsjóður námsmanna