Detection, characterization and functional study of mutations on tumor suppressor and repair genes related to carcinogenesis

Hereditary cancer accounts for a small percentage of cancer incidents and is characterized by cancer development at young age and the presence of multiple cases of related malignancies among family members. Breast cancer is the most common malignancy and the leading cause of the death among women in developed and developing countries. Approximately 30% of breast cancer cases present family history with at least two relatives diagnosed with cancer (familial cases), while in 5-10% a mutation in a susceptibility gene has been identified. Hereditary breast cancer is related to germline mutations in BRCA1 and BRCA2 genes. Both genes play key roles in homologous recombination, a very important repair pathway of DNA double strand breaks. The lifetime breast cancer risk is 57-65% for BRCA1 and 35-57% for BRCA2 mutation carriers. Over the last years, the use of Next Generation Sequencing (NGS) highlighted new susceptibility breast cancer genes, such as PALB2, ATM and CHEK2. All the above genes are also participate in homologous recombination.Apart from the mentioned genes, mismatch repair genes (MMR) are known cancer susceptibility genes (MLH1, MSH2, MSH6 και PMS2). Germline mutations in MMR genes are associated with ovarian cancer development, one of the main characteristics of Lynch syndrome, among other malignancies. Identification of germline mutations of cancer predisposing genes explains a percentage of diagnosed incidents. However, there is still a significant proportion of familial cases in which the genetic background of cancer development remains unidentified. This is a trigger for the investigation of alternative mechanisms that may be involved in carcinogenesis, such as epigenetic alterations and specifically methylation. Changes of methylation patterns is associated with cancer development through gene expression modifications inducing genetic instability. The aim of the dissertation was to investigate the genetic background of Greek breast,ovarian and Lynch syndrome patients using different approaches/techniques in order to identify new susceptibility genes and characterize new mutations that are associated with various types of cancer. At the same time, epigenetic silencing through hypermerthylation of genes that possibly participate on cancer development was investigated on patients whose hereditary background remained undefined. Originally, 172 breast cancer patients were analyzed for the identification of pathogenic variants on BRCA genes by Sanger sequencing. The analysis revealed 12.2% BRCA1 and 5.2% BRCA2 mutation carriers. The patients that carried no point mutation were further analyzed by MLPA for the detection of Large Genomic Rearrangements (LGRs) on these genes and no carriers were identified. In order to determine the prevalence of BRCA LGRs on Greek patients, the MLPA analysis was expanded in 443 additional breast cancer patients. This analysis revealed two deletions (0.5%), one on BRCA1 gene (deletion of exons 1-2) and one on BRCA2 gene (deletion of exons 12-13). The latter LGR is quite common for people of Greek ancestry. Furthermore, NGS was employed on breast cancer patients (108) that were not BRCA mutation carriers and presented extremely severe family history. «TruSight Cancer Panel» that includes 94 cancer susceptibility genes, was used and seventeen (17/108, 15.7%) mutations on known and less known cancer susceptibility genes, were identified. Specifically, five PALB2, four CHEK2, two RAD51C, two TP53 and one on ALK and FANCM variants were detected. ATM and CHEK2 are known predisposing breast cancer genes, while PALB2 has been recently identified as a high penetrant gene. RAD51C is identified as a susceptibility gene to ovarian cancer, although late studies have shown that is possible certain variants to influence breast cancer development as well. This hypothesis is in accordance with the results of the present work. Finally, FANCM gene quite recently has been associated with breast cancer predisposition, whose mutations are rare, as it is supported in the present study. Next Generation Sequencing revealed a recurrent PALB2 mutation c.2257C>T. So, we aimed to clarify its possible founder effect on Greek population as well as to investigate correlations with cancer diagnosis. Genotyping for the mutation was performed on 2496 breast and 697 ovarian cancer patients and identified 6 (0.24%) and 1 (0.14%) carriers, respectively, while haplotype analysis performed on all mutation carriers. Haplotype analysis was conducted using seven microsatellite markers (one intragenic and 6 extragenic) and all carriers shared a 1.2 Mb common haplotype “157-228-127-166-263” indicating that this variant came from a single recombination event in a common ancestor 1600 years ago.In addition, as mentioned above, germline mutations on MMR genes are associated with hereditary cancer. Thus, 93 probands selected according to their personal (early onset diagnosis) and/or family history (presence of Lynch syndrome related malignancies) were analyzed in order to determine the mutation spectra of MMR genes on Greek patients. Point mutations or small insertions/deletions were detected in 29/93 and specifically mutations in MLH1 and MSH2 were predominantly identified (25.8%), while the proportion of MSH6 and PMS2 was significantly lower, 4.3% and 1.1% respectively. As a next step, MLPA was employed on non-mutation carriers for the detection of LGRs on MLH1 and MSH2 genes which represent the majority of the rearrangements that have been described on MMR genes. Genomic rearrangements identified on MSH2 exclusively (8/93, 8.6%) involving deletions of exons 1-6, 1-7, 1-8, 3-4, 9-10 and 7-16, indicating that such phenomena are possibly frequent in patients of Greek descent. Finally, 1-6, 3-4, 9-10 and 7-16 break points were determined. Furthermore, NGS analysis pointed out a proportion of patients that carry no mutation on breast cancer predisposing genes. This observation lead us to investigate the promoter methylation status of 22 genes, related to different repair pathways, of patients diagnosed at early age and triple negative tumors. The results compared to BRCA1 mutation-carriers patients with corresponding diagnoses. This analysis revealed 5 genes with hypermethylated promoters (methylation percentage> 30%), CDH1, HIC1, PYCARD, RASSF1 and TP73, demonstrating a possible correlation of epigenetic silencing of these genes with disease development.Overall, the present dissertation revealed the genetic diversity of the Greek population which at the same time is characterized by strong founder effects in terms of hereditary cancer and in particular hereditary breast and ovarian cancer. In addition, the contribution of epigenetic silencing, hypermethylation, of specific genes that are involved in crucial for carcinogenesis signaling pathways was shown. Clarification and understanding of genetic background and mechanisms that contribute in carcinogenesis is very important in order to provide patients and their family members appropriate clinical management.Ο κληρονομικός καρκίνος αντιπροσωπεύει ένα μικρό ποσοστό των περιστατικών του καρκίνου που διαγνώσκονται και χαρακτηρίζεται από την ανάπτυξη κακοηθειών σε νεαρή ηλικία και την παρουσία πολλαπλών περιστατικών σχετιζόμενων καρκίνων στα μέλη των οικογενειών. Ο καρκίνος του μαστού είναι η πιο συχνή κακοήθεια και η κύρια αιτία θανάτου στις γυναίκες τόσο στις αναπτυγμένες, όσο και στις αναπτυσσόμενες χώρες. Περίπου στο 30% των περιπτώσεων του καρκίνου του μαστού διαγνώσκονται τουλάχιστον δύο συγγενείς (οικογενής) με κακοήθεια, ενώ στο 5-10% έχουν χαρακτηριστεί σαφείς μοριακές αλλαγές (κληρονομικός). Τα δύο κύρια γονίδια, μεταλλαγές των οποίων έχουν συσχετιστεί με κληρονομική προδιάθεση στον καρκίνο του μαστού, είναι τα BRCA1 και BRCA2 που συμμετέχουν στο μονοπάτι του ομόλογου ανασυνδυασμού. Ο ομόλογος ανασυνδυασμός είναι ένας μηχανισμός επιδιόρθωσης των θραύσεων της διπλής αλυσίδας του DNA. Ο δια βίου κίνδυνος ανάπτυξης καρκίνου του μαστού σε γυναίκες που φέρουν μεταλλαγές στο γονίδιο BRCA1 είναι 57-65%, ενώ ο αντίστοιχος κίνδυνος για το γονίδιο BRCA2 είναι 35-57%. Τα τελευταία χρόνια η χρήση της Αλληλούχισης DNA Νέας Γενιάς (Next Generation Sequencing, NGS) έχει αναδείξει και άλλα γονίδια προδιάθεσης στον καρκίνο του μαστού, υψηλής και ενδιάμεσης διεισδυτικότητας, όπως είναι τα PALB2, ATM και CHEK2. Τα γονίδια αυτά εμπλέκονται επίσης στο μονοπάτι του ομόλογου ανασυνδυασμού. Εκτός από τα παραπάνω γονίδια, με τον κληρονομικό καρκίνο έχουν συσχετιστεί και τα γονίδια που εμπλέκονται στο μονοπάτι επιδιόρθωσης αταίριαστων βάσεων, τα γονίδια MMR (MLH1, MSH2, MSH6 και PMS2). Η παρουσία παθογόνων μεταλλαγών σε αυτά τα γονίδια έχει συσχετιστεί με προδιάθεση ανάπτυξης καρκίνου των ωοθηκών, ένα από τα κύρια χαρακτηριστικά του συνδρόμου Lynch.Η ανίχνευση μεταλλαγών σε γονίδια προδιάθεσης εξηγεί ένα ποσοστό των περιστατικών του καρκίνου που διαγνώσκονται. Παραμένει όμως ένα ποσοστό περιστατικών με οικογενή χαρακτήρα στο οποίο δεν έχει ανιχνευθεί ο γενετικός παράγοντας που είναι υπεύθυνος για την εμφάνιση της νόσου. Αυτό οδηγεί στην ανάγκη διερεύνησης εναλλακτικών μηχανισμών που μπορεί να συμβάλλουν στην καρκινογένεση, όπως είναι οι επιγενετικές τροποποιήσεις και συγκεκριμένα η μεθυλίωση. Η αλλαγή των επιπέδων της μεθυλίωσης έχει συσχετιστεί με την καρκινογένεση, κυρίως μέσω της τροποποίησης της έκφρασης των γονιδίων επάγοντας τη γενετική αστάθεια. Σκοπός της παρούσας διατριβής αποτέλεσε η διερεύνηση του γενετικού υπόβαθρου σε ασθενείς Ελληνικής καταγωγής με καρκίνο μαστού, ωοθηκών και σχετιζόμενων κακοηθειών με το σύνδρομο Lynch με τη χρήση διαφορετικών προσεγγίσεων/τεχνικών, ώστε να χαρακτηριστούν νέα γονίδια και μεταλλαγές που σχετίζονται με τις διάφορες μορφές καρκίνου. Παράλληλα, έγινε διερεύνηση μηχανισμών αποσιώπησης, όπως είναι η μεθυλίωση, των γονιδίων που πιθανά επηρεάζουν την ανάπτυξη καρκίνου σε ασθενείς που δεν είχε αποσαφηνιστεί το γενετικό υπόβαθρο της νόσου.Αρχικά, αναλύθηκαν 172 ασθενείς με καρκίνο του μαστού για τα γονίδια BRCA. Από την ανάλυση αυτή προέκυψε ότι το 12,2% έφερε μεταλλαγές στο BRCA1 και 5,2% στο BRCA2. Στη συνέχεια οι ασθενείς που ήταν αρνητικές για σημειακές μεταλλαγές αυτών των γονιδίων υποβλήθηκαν σε έλεγχο με τη τεχνική MLPA για την ανεύρεση μεγάλων γονιδιακών αναδιατάξεων. Κατά την ανάλυση αυτή δεν ανιχνεύθηκε καμία γενετική αναδιάταξη. Για να είναι εφικτός ο καθορισμός της παρουσίας αναδιατάξεων στον Ελληνικό πληθυσμό, η ανάλυση με MLPA διευρύνθηκε σε επιπλέον 443 ασθενείς και ανιχνεύθηκαν δύο απαλοιφές (0,5%), μία στο BRCA1 (απαλοιφή των εξονίων 1-2) και μία στο BRCA2 (απαλοιφή των εξονίων 12-13). Η τελευταία αποτελεί ένα σχετικά συχνό έλλειμμα στον Ελληνικό πληθυσμό. Στη συνέχεια αναλύθηκαν ασθενείς με καρκίνο του μαστού (108), οι οποίες ήταν αρνητικές για μεταλλαγές στα γονίδια BRCA και είχαν εξαιρετικά βεβαρημένο οικογενειακό ιστορικό. Για την ανάλυση αυτή χρησιμοποιήθηκε η μεθοδολογία NGS και συγκεκριμένα χρησιμοποιήθηκε το γονιδιακό πάνελ «TruSight Cancer Panel», το οποίο περιλαμβάνει 94 γονίδια προδιάθεσης σε διαφόρους τύπους κακοήθειας. Η ανάλυση ανέδειξε την παρουσία 17 (15,7%) μεταλλαγών σε γνωστά και νέα γονίδια προδιάθεσης στον καρκίνο του μαστού. Ειδικότερα, ανευρέθηκαν 5 παραλλαγές στο PALB2, 4 στο CHEK2, 2 στο ATM, 2 στο RAD51C, 2 στο TP53, και από μία στο ALK και στο FANCM. Τα ATM και CHEK2 είναι γνωστά γονίδια προδιάθεσης ενδιάμεσης διεισδυτικότητας, ενώ το PALB2 έχει αναδειχθεί πλέον σε γονίδιο υψηλής διεισδυτικότητας. Το RAD51C έχει συσχετιστεί με προδιάθεση στον καρκίνο των ωοθηκών, διαφαίνεται όμως ότι συγκεκριμένες μεταλλαγές μπορεί να συσχετίζονται και με προδιάθεση στον καρκίνο του μαστού. Η υπόθεση αυτή υποστηρίζεται και από τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής. Τέλος, το FANCM είναι ένα γονίδιο που έχει συσχετιστεί πρόσφατα με προδιάθεση στον καρκίνο του μαστού, οι μεταλλαγές του οποίου ανευρίσκονται σε μικρή συχνότητα, όπως και στην παρούσα μελέτη (0,9%). Η ανάλυση με NGS ανέδειξε ότι η μεταλλαγή c.2257C>T του γονιδίου PALB2 ανευρίσκεται σχετικά συχνά στις Ελληνίδες ασθενείς. Αυτό αποτέλεσε το έναυσμα να αναλυθούν για τη συγκεκριμένη μεταλλαγή επιπλέον 2496 ασθενείς με καρκίνο του μαστού και 697 ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών. Συνολικά ανευρέθηκαν 6 (0,24%) με καρκίνο του μαστού που έφεραν την μεταλλαγή, ενώ μόνο μία ασθενής με καρκίνο των ωοθηκών (0,14%) έφερε τη c.2257C>T μεταλλαγή. Ακολούθησε ανάλυση απλοτύπων με τη χρήση 7 πολυμορφικών δεικτών σε όλα τα άτομα που έφεραν τη μεταλλαγή και προέκυψε ότι όλοι έφεραν ένα κοινό απλότυπο μεγέθους 1,2 Kb. Η ύπαρξη του κοινού απλοτύπου “157-228-127-166-263” ανέδειξε ότι η c.2257C>T μεταλλαγή προέκυψε από έναν κοινό πρόγονο πριν από περίπου 1600 χρόνια. Με τον κληρονομικό καρκίνο, όπως αναφέρθηκε και προηγουμένως, έχουν συσχετιστεί και τα γονίδια MMR, οπότε σε επόμενο βήμα ελέγχθηκαν 93 ασθενείς βάση του ατομικού (νεαρή ηλικία διάγνωσης) ή/και του οικογενειακού ιστορικού τους (παρουσία σχετιζόμενων καρκίνων με το σύνδρομο Lynch). Η ανάλυση αυτή οδήγησε στην ανίχνευση συνολικά 29 μεταλλαγών στα γονίδια αυτά και συγκεκριμένα 17 μεταλλαγών στο MLH1 (18,3%), 7 στο MSH2 (7,5%), 4 στο MSH6 (4,3%) και 1 στο PMS2 (1,1%). Στη συνέχεια, οι ασθενείς που ήταν αρνητικοί για σημειακές μεταλλαγές των γονιδίων MMR ελέγχθηκαν για την ανίχνευση μεγάλων γονιδιακών αναδιατάξεων των γονιδίων MLH1 και MSH2, γονίδια τα οποία αριθμούν το μεγαλύτερο αριθμό παραλλαγών. Από την ανάλυση αυτή ανευρέθηκαν 8 απαλοιφές στο γονίδιο MSH2 (8,6%), ειδικότερα ανιχνεύθηκαν οι απαλοιφές των εξονίων 1-6, 1-7, 1-8, 3-4, 9-10 και 7-16, καταδεικνύοντας τη μεγάλη συχνότητα ανεύρεσης αναδιατάξεων στο συγκεκριμένο γονίδιο. Τέλος, καθορίστηκαν τα ακριβή όρια θραύσης των ελλειμμάτων 1-6, 3-4, 9-10 και 7-16. Επιπλέον, μετά την ανάλυση με NGS παρέμενε ένα ποσοστό ασθενών στο οποίο δεν ανιχνεύθηκε μεταλλαγή σε κανένα από τα γονίδια προδιάθεσης που αναλύθηκαν. Για το λόγο αυτό προχωρήσαμε σε ανάλυση των επιπέδων μεθυλίωσης των υποκινητών 22 γονιδίων σε επιλεγμένες ασθενείς με νεαρή ηλικία διάγνωσης και τριπλά αρνητικούς όγκους. Τα αποτελέσματα συγκρίθηκαν με τα αποτελέσματα από ασθενείς, με αντίστοιχες διαγνώσεις, οι οποίες όμως έφεραν μεταλλαγές στο γονίδιο BRCA1, δηλαδή γνωστό γενετικό υπόβαθρο. Η ανάλυση αυτή ανέδειξε 5 γονίδια με υπερμεθυλιωμένους υποκινητές (ποσοστό μεθυλίωσης >30%), τα CDH1, HIC1, PYCARD, RASSF1 και TP73, καταδεικνύοντας πιθανή συσχέτιση της επιγενετικής αποσιώπησης αυτών των γονιδίων με την ανάπτυξη της νόσου. Συμπερασματικά από την παρούσα διατριβή αναδείχθηκε τόσο η γενετική ποικιλομορφία όσο και η παρουσία ιδρυτικών μεταλλαγών που χαρακτηρίζουν τον κληρονομικό καρκίνο και ιδιαίτερα τον καρκίνο μαστού και ωοθηκών στον Ελληνικό πληθυσμό. Επιπλέον, δείχθηκε η συμβολή της επιγενετικής αποσιώπησης, υπερμεθυλίωση, συγκεκριμένων γονιδίων τα οποία εμπλέκονται σε καθοριστικά σηματοδοτικά μονοπάτια που επάγουν την καρκινογένεση. Η κατανόηση και η αποσαφήνιση του γενετικού υπόβαθρου και των μηχανισμών που συμμετέχουν στην παθογένεια της νόσου είναι πολύ σημαντική, ώστε να παρέχεται στους ασθενείς και στα μέλη των οικογενειών τους, η κατάλληλη γενετική συμβουλή και να πραγματοποιείται η βέλτιστη κλινική διαχείριση