Environmental risk assessment and toxicity of pharmaceuticals in coastal tropical and temperate organisms

Demographic attributes of the urban society have prompted a milestone shift towards structural aging of global population and increase of life expectancy, crucial to the prominence of cancer as one of the non-communicable diseases leading mortality. Currently, cancer diseases were accountable for about 9.6 million deaths in 2018, with concerning increasing projections of cancer incidence and mortality, by 2030, at a greater proportion in developing countries. As a result, there is an increasing trend of production and consumption of pharmaceuticals applied in cancer treatments. Once administered and metabolized, such drugs are excreted into waterways following to waste water treatment plants (WWTPs), ending up in freshwater and coastal ecosystems, where they can be found at a sub ng to ng L-1 range. Anticancer drugs are designed to damage DNA and disrupt mechanisms of its transcription, replication and synthesis, as well as suppress the cell´s defense, ultimately causing cell death. In cancer therapy, drugs are typically administered in a combinatory cocktail, that covers different molecular targets, reducing the risk of clonal selection based upon cell resistance to a single drug. However, these chemicals may bring potential toxicity if discharged into the aquatic environment, both in temperate and tropical zones, particularly in the benthic compartment, where they are expected to accumulate. In this sense, the present thesis aimed to assess the effects of anticancer agents of different classes, namely the cytotoxic platinum-based cisplatin (CisPt), the alkylating agent cyclophosphamide (CP) and the endocrine disruptor tamoxifen (TAM), on non-target benthic marine species under realistic environmental concentrations, at individual and combined exposures. For this purpose, a multi-biomarker approach was applied including the assessment of behavioural responses, oxidative stress, biotransformation, neurotoxicity, lipid peroxidation and genotoxicity in the temperate polychaete Nereis diversicolor, in addition to the evaluation of acute and chronic effects of drugs in tropical and representative benthic organisms: the sea urchin Echinometra lucunter, the polychaete Scolelepis squamata and the amphipod Tiburonella viscana from the Brazilian coast. The main results revealed that single drug exposures caused alteration of AChE activity, oxidative stress and oxidative damage and, ultimately, DNA damage in N. diversicolor. Besides, alterations in its burrowing behaviour also occurred, as an ecological outcome. These effects were more pronounced in organisms under CisPt at 100 ng Pt L-1, CP at 1000 ng L-1 and TAM at 0.5 ng L-1. Findings from bioassays with N. diversicolor conducted with drugs in tertiary mixtures indicated that each biomarker effect respond differently, according to the trends proposed by models of drugs´s interaction. Toxicity did not increase in a dose-response manner but showed different patterns of effects, in a way that the highest DNA damage was observed at the set of lowest concentrations (Mixture A), an absence of oxidative stress at the intermediary drug levels (Mix B and C), with a potential dominance of TAM´s MoA in organisms exposed to Mixture C and D, suggesting an antagonist interaction between the cytotoxic drugs. Therefore, the effects ruled by single-drug MoAs cannot provide estimations and protective measures for a prospective ERA regarding scenarios of their combination in the environment. Although evidence on estrogen receptors expression is still not disclosed for the herein selected biological models, determination of biochemical and genotoxic outcomes from TAM exposure are highlighted, since it is assumed to comprise a targeted therapy on nuclear estrogen receptors. Anticancer drugs´ concentrations that triggered the above-mentioned responses are potentially present in coastal environments, even more prone to be encountered in developing regions, where technologies of WWTPs are not efficient or are lacking. Accordingly, effects regarding the bioassays conducted with the tropical counterparts showed a non-monotonic reduction of viable pluteus larvae of E. lucunter, at CisPt and CP treatment respectively at the range from 0.1 to 10 ng Pt L-1, and from 50 to 500 ng CP L-1, in contrast to the increasing reduction of embryo larval development under TAM exposure, significant over the whole range of concentrations. In polychaetes S. squamata, a significant acute toxicity was exerted at the higher pharmaceutical doses (Mix C and D). In the amphipod T. viscana demonstrated a higher sensitivity to pharmaceuticals, presenting a significant non-linear reduction of survival in Mix B and D, as a potential outstanding effect of TAM when present as mixtures. By virtue of the non-monotonicity addressed in the dose-responses relationships reported in all bioassays, another concern stands out on the urgency to the development of a risk analysis and safety assessment designated to anticancer drugs.Atualmente, a dinamica demográfica global demonstra uma excepcionl tendência de transição regida pelo envelhecimento populacional e pelo aumento da esperança média de vida. Estes fatores, combinados a atributos sociais relacionados aos hábitos modernos e exposição a fatores de risco (e.g. dieta inapropriada, tabaco, sedentarismo, consumo de álcool, agentes infecciosos), aliados à hereditariedade, contribuem para um significativo aumento da incidência dos casos de cancro, classificado como a doença mais preocupante do século, após os distúrbios cardiovasculares. Atualmente, o cancro representa 21,7% dos casos de morte a nível mundial, com projeções preocupantes para 2030, e maiores proporções de incidência em países em desenvolvimento. Dessa forma, estima-se uma consequente expansão na necessidade de produção e consumo de medicamentos anticancerígenos em todo o mundo, com aumento anual entre 6 – 8% estimado para o ano de 2018, comparado com os 6,5% nos últimos 5 anos. Após o consumo, via administração oral ou intravenosa, os fármacos anticancerígenos são excretados na sua forma parental e metabolizada através de efluentes hospitalares e industriais, bem como por descargas de esgotos provenientes de estações de tratamento de águas residuais (ETARs), as quais não possuem tecnologia adequada para a remoção de moléculas orgânicas complexas. Dessa forma, as águas superficiais e marinhas são os destinos finais desses medicamentos. Esta classe terapêutica atua sobre biomoléculas e componentes celulares críticos à proliferação celular, tais como DNA, RNA, proteínas, membrana fosfolipídica, microfilamentos do citoesqueleto e sinalização celular, a fim de causar danos irreversíveis e morte celular. Contudo, estes alvos não são específicos de células tumourais, pois, as drogas interferem em células proliferativas normais, como as dos organismos aquáticos. Apesar da crescente quantidade de informação envolvendo fármacos no âmbito da ecotoxicologia aquática, verifica-se uma escassez de dados sobre o impacto de drogas anticancerígenas no meio marinho. Em países em desenvolvimento, onde são escassas as políticas de saneamento ambiental e a implementação de infraestruturas avançadas em ETARs, o cenário de risco ambiental torna-se ainda mais elevado frente à contaminação por estes fármacos. Além disso, a investigação acerca dos efeitos de fármacos em organismos nativos de ambiente (sub)tropical é escassa, e ausente relativamente aos anticancerígenos, dentro de um âmbito em que os critérios de qualidade ambiental em países em desenvolvimento são baseados em extrapolações de respostas geradas em organismos de zonas temperadas da Europa e América do Norte. O sedimento consiste num compartimento de destino final das substâncias introduzidas nos ecossistemas aquáticos, capaz de acumulá-las em níveis muito mais elevados do que aqueles observados na coluna de água adjacente. Além de atuarem como repositório de compostos químicos, os sedimentos atuam também como fonte de poluição após eventos de remobilização. Portanto, por meio do contato com a água intersticial e material particulado, as espécies bentónicas estão constantemente expostas a misturas de compostos químicos. Dessa forma, a presente tese teve como objetivo avaliar a toxicidade de fármacos anticancerígenos, globalmente administrados em coquetéis no tratamento contra o cancro, em organismos marinhos bentónicos representativos de zonas temperadas e tropicais. Estes organismos foram expostos a drogas individualmente e em misturas, a concentrações ambientalmente relevantes. Os fármacos selecionados para tal foram os citotóxicos cisplatina (CisPt – 0,1 a 100 ng Pt L-1) e ciclofosfamida (CP – 10 a 1000 ng L-1), aplicadas no tratamento de tumoures sólidos (e.g. ovário, pulmão e bexiga), e o disruptor endócrino tamoxifeno (TAM - 0,5 a 100 ng L-1), mundialmente aplicado no tratamento do cancro da mama. Foram usados como modelos os poliquetas Nereis diversicolor de ambientes marinhos temperados e o ouriço-do-mar Echinometra lucunter, o anfípoda Tiburonella viscana e o poliqueta Scolelepis squamata característicos de ambientes tropicais. Nas experiências de exposição com N. diversicolor, que tiveram a duração de 14 dias, avaliaram-se as respostas de biomarcadores de estresse oxidativo (superóxido dismutase -SOD; catalase – CAT; enzima de fase II glutationa-S-transferase – GST; glutationa peroxidase - GPx), dano oxidativo (peroxidação lipídica - LPO), de efeito neurotóxico (atividade da enzima acetilcolinesterase - AChE), genotoxicidade por dano ao ADN, e alteração do comportamento de escavação. Relativamente aos organismos de ambientes bentônicos tropicais foram efetuados ensaios agudos (mortalidade) e crônicos (desenvolvimento embrio-larval). Os resultados obtidos indicaram que as drogas anticancerígenas, expostas individualmente, causam alterações neutotóxicas significativas, estresse e dano oxidativo e genotoxicidade em N. diversicolor. Além disso, registram-se alterações no comportamento de escavação que podem comprometer a proteção da espécie aos predadores presentes na superfície do sedimento, com consequências a nível ecológico. Estas respostas foram mais significativas em organismos expostos a CisPt (100 ng Pt L-1), CP (1000 ng L-1) e TAM (0,5 ng L-1). Relativamente ao bioensaio conduzido em misturas ternárias, constatou-se que o perfil de toxicidade não ocorreu de maneira monotónica. A mistura contendo os anticancerígenos em menor concentração (Mistura A) foi responsável pelo maior grau de dano em ADN, enquanto que nas concentrações intermedias (Misturas B e C) não se registou estresse oxidativo. Comparando-se com os resultados obtidos na exposição aos fármacos individualmente, as misturas C e D indicaram uma potencial predominância dos efeitos do TAM, com efeito antagônico sobre CisPt e CP. Assim, pode-se inferir que as respostas desencadeadas pelo modo de ação dos fármacos presentes individualmente não são consistentes para gerar estimativas de medidas de proteção de avaliação de risco ambiental relativamente a misturas destes compostos. Os efeitos causados pela concentração do anticancerígeno TAM (0,5 ng L-1), individualmente ou em misturas, indicaram um modo de ação por meio da intrusão da pró-droga na membrana celular. Logo, apesar da ausência de evidências referente à expressão de recetores de estrogénio nos modelos biológicos selecionados, a terapia administrada com TAM é também potencialmente tóxica em organismos não alvos da droga. As concentrações das drogas, responsáveis por desencadear as respostas de toxicidade aguda, foram detetadas em ambientes temperados, e são encontradas em zonas costeiras tropicais. Significativa redução do desenvolvimento embrio-larval do ouriço E. lucunter foi verificada nos bioensaios conduzidos com CisPt e CP, respectivamente em concentrações entre 0.1 a 10 ng Pt L-1 e 50 a 500 ng CP L-1, de maneira não-monotónica. Em contrapartida, o ensaio com TAM indicou uma resposta monotónica de redução significativa da viabilidade larval com o aumento da concentração da droga. O ensaio conduzido com misturas e poliquetas S. squamata demonstrou significativa toxicidade aguda com o aumento da concentração (Misturas C e D), apesar de uma sensibilidade inferior aos anfípodas T. viscana, os quais demonstraram uma redução significativa e não-linear da sobrevivência nas misturas B e D, como potencial efeito da ação do TAM. Devido aos perfis de toxicidade e dose-resposta não-monotónicos reportados em todos os bioensaios conduzidos com concentrações-traço ambientalmente relevantes, destaca-se a vulnerabilidade de espécies costeiras às misturas desses contaminantes emergentes, bem como à urgência de medidas preventivas à entrada desses compostos no meio marinho e ao desenvolvimento ferramentas de avaliação de risco ambiental especialmente dirigida a esses fármacos de expressiva toxicidade.The present thesis was financed and supported by the Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq - Brazil), through the Ciência Sem Fronteiras Program (202360/2014-8