Evaluation of cytotoxic activity of synthetic bis-indolyl methanes: structure-activity relationship

Dissertação de mestrado, Ciências Farmacêuticas, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2016Cancer is defined as a group of more than 100 diseases responsible for uncontrolled cellular growth, local tissue invasion and distant metastases. In 2012, the World Health Organization expected a rise by about 70% of the number of new cases of cancer in the next two decades. With the exponential development of cancer and the low survival ratio for leukaemia and lymphoma, it is urgent to develop new drugs able to fight cancer cells and improve anticancer treatments. The study of bis-indolyl methane (BIM) compounds may constitute a valuable contribution to tackle this problem. BIM, also known as 3,3-di-indolylmethane, is a natural metabolite of indole-3-carbinol that occurs in Brassica genus plants (cruciferous plants); and with described biological activities such as antibacterial, antifungal, analgesic, anti-inflammatory, anthelmintic, cardiovascular and anticancer. The main objectives of this work were to study the cytotoxic activity of BIMs with oxime and hydrazone derivatives, to relate their chemical structure with the cytotoxic activity and to compare BIMs with actual therapeutics. The cytotoxic assays were done in THP-1 (leukaemia), EL-4 and U937 (lymphoma) and S17 (bone marrow) cell lines; and revealed that CG-141 was the most active compound towards EL-4, THP-1 and U937 while AL-522B was the most selective compound towards S17. When compared with hydrazone derivatives, oxime derivatives had a stronger biological activity in the studied cell lines. Relating the studied compounds with the compound 9a, it was possible to conclude that 9a continues to be the most biological active compound towards EL-4, THP-1 and U937 and the most selective towards S17. None of the studied compounds presented significant hemolytic activity in a hemolytic assay, which corroborated the theory of a nuclear action mechanism. BIMs and vinca alkaloids have the same pharmacophores, which suggests that they might have a similar mechanism of action.O cancro é definido com um grupo de mais de 100 patologias responsáveis pelo crescimento celular descontrolado, invasão de tecidos e metástases. Classificado de acordo com o tipo de células que o constituem, este pode ser designado por carcinoma, sarcoma, leucemia, linfoma, mieloma múltiplo, melanoma ou outros tipos de cancro. Sendo a segunda causa de morte na Europa e nos Estados Unidos da América, a Organização Mundial de Saúde esperava, em 2012, um aumento de cerca de 70% de novos casos de cancro nas duas décadas seguintes. Com mecanismos bastante complexos, a carcinogénese é classificada em três fases, sendo elas: iniciação – exposição das células normais a substâncias carcinogénicas ou a alterações genéticas; promoção – quando as células sujeitas a agentes cancerígenos e fatores de crescimento ambientais se tornam cancerígenas; e progressão – quando há o aumento de proliferação celular, resultando num tumor ou desenvolvimento de metástases. Além destas três fases, existem também um total de dez características que são adquiridas durante o desenvolvimento de um tumor, compreendendo capacidades biológicas fundamentais das células cancerígenas: i) sinal proliferativo permanente; ii) fuga aos supressores de crescimento; iii) resistência à morte celular; iv) capacidade de imortalidade replicativa; v) indução da angiogénese; vi) ativação da invasão e metastização das células cancerígenas; vii) reprogramação da energia celular; viii) evasão às defesas imunológicas; ix) instabilidade do genoma; e x) inflamação promotora de tumores. Dentro das doenças oncológicas incluem-se as leucemias e os linfomas. Existem quatro tipos principais de leucemias: leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda e leucemia linfocítica crónica; e dois grandes grupos de linfomas, Hodgkin e Não-Hodgkin, que incluem um total de mais de 50 subtipos. Existem diferentes modalidades de combate ao cancro entre as quais se inclui a quimioterapia. Esta utiliza fármacos classificados como: i) Agentes alquilantes que podem atuar por DNA cross-link (ex.: mecloretamina, carmustina, busulfano), por metilação do DNA (ex.: procarbazina) e por ligação cruzada intra e inter cadeias de DNA (ex.: cisplatina, carboplatina e oxaliplatina); ii) Antimetabolitos que atuam por competição, inibindo a biossíntese de nucleótidos (ex.: antifolatos como o metotrexato, fluoropirimidinas como o 5-fluoruracilo, análogos da desoxicitidina como a citarabina e análogos das purinas como a 6-mercaptopurina); iii) Produtos naturais: alcaloides da vinca (ex.: vimblastina, vincristina e vinorelbina) que inibem a mitose por polimerização da tubulina; taxanos (ex.: paclitaxel) que também inibem a mitose; epipodofilotoxinas (ex.: etoposido que inibe a topoisomerase II); e camptotecinas (ex.: topotecano e irinotecano) que inibem a topoisomerase I; iv) Antibióticos, incluindo antraciclinas (ex.: doxorrubicina) que inibem a topoisomerase II, intercalam o DNA e libertam radicais livres de oxigénio, mitomicina e bleomicina que atuam por um mecanismo de alquilação e de libertação de radicais, respetivamente; v) Fármacos mistos que incluem o imatinib, o dasatinib, o nilotinib, inibidores dos recetores dos fatores de crescimento e asparaginase. Com o desenvolvimento exponencial do cancro e a baixa taxa de sobrevivência a leucemias e linfomas, há uma grande necessidade de desenvolvimento de novos fármacos capazes de combater células cancerígenas e melhorar os tratamentos oncológicos, uma vez que estes apresentam bastantes efeitos adversos (náuseas, vómitos, diarreia, fadiga, mielossupressão, neutropenia, trombocitopenia, hepatotoxicidade, alopecia, mucosite, entre outros). O estudo de bis(indolil)metanos (BIMs) poderá constituir uma vantagem face a este grande grupo de doenças, em especial, leucemia e linfomas. BIM, também conhecido como 3,3-diindol metano, é um metabolito natural do indole-3-carbinol, que está presente em plantas do género Brassica (plantas crucíferas como brócolos, couves de bruxelas, couve-flor, couve e repolho) e tem descritas atividades biológicas como atividade antibacteriana, antifúngica, analgésica, anti-inflamatória, anti-helmíntica, cardiovascular e anticancerígena. Durante o processo de desenvolvimento de um fármaco existem diferentes etapas envolvidas: descoberta, design e desenvolvimento. A etapa de design de um fármaco consiste na identificação de relação estrutura-atividade deste, assim como do seu farmacóforo, de modo a melhorar as propriedades farmacodinâmicas e farmacocinéticas. Contudo, devido à utilização de recursos limitados e às limitações impostas à experimentação animal ao longo dos últimos anos, esta componente do desenvolvimento tem-se tornado cara e longa. Assim, e como forma de colmatar estas dificuldades, surgiram os modelos computacionais de relação estrutura-atividade e estudos in silico. Os principais objetivos deste trabalho consistiram no estudo da atividade citotóxica dos BIMs com derivações de oximas e hidrazonas, na relação da estrutura química com a respetiva atividade citotóxica e na comparação dos BIMs com os fármacos atualmente usadas em terapêutica. Desta forma, começou por se determinar a atividade citotóxica dos compostos em estudo (derivados de oximas: CG-99-1, CG-109, CG-141 e CG-142; derivados de hidrazonas: AL-516, AL-522B, CG-92, CG-105, CG-147, CG-151 e CG-153) e do composto etoposido nas linhas celulares de EL-4 (linfoblastos de murino), THP-1 (leucemia aguda monocítica humana), U937 (linfoblastos de pulmão humanos) e S17 (estroma de medula óssea de murino), mediante ensaio colorimétrico com MTT, seguindo-se o cálculo da respetiva seletividade. Foi também determinada a atividade hemolítica dos compostos em estudo. Os resultados revelaram que o composto CG-141 foi o que apresentou melhor atividade biológica: EL-4 (IC50=3,01-3,47 μM), THP-1 (IC50=5,79-6,94 μM) e U937 (IC50=9,79-10,3 μM). Já o composto AL-522B apresentou melhores valores de seletividade face à linha celular S17: 3,10 para EL-4, 2,49 para THP-1 e 2,55 para U937. Quando comparados com os derivados de hidrazonas, os BIM derivados de oximas revelaram maior atividade biológica nas linhas celulares estudadas. Relativamente ao composto 9a, analisado num estudo prévio, este continua a apresentar melhor atividade biológica e seletividade nas linhas celulares estudadas, destacando assim a importância do hidrogénio na posição R2 do BIM. Quando compara a atividade citotóxica do composto 9a com o etoposido, verificaram-se valores de IC50 semelhantes, traduzindo-se numa atividade citotóxica bastante similar entre ambos. Nenhum dos compostos estudados apresentou atividade hemolítica significativa, corroborando desta forma a teoria de um mecanismo de ação a nível nuclear. Ao comparar a estrutura dos BIMs com os fármacos atualmente utilizados em terapêutica, foi possível concluir que os BIMs e os alcaloides da vinca apresentam o mesmo farmacóforo – dois índoles -, o que pode sugerir um mecanismo de ação semelhante. Em conclusão, novas estratégias de abordagem química e ensaios biológicos devem ser feitos de modo a complementar os dados obtidos e a melhorar moléculas com potencial de utilização citotóxica. A utilização de substituintes alquil e aril juntamente com oximas e hidrazonas sugerem a criação de compostos promissores no tratamento de células tumorais não aderentes. Grupos heteroarilo, fosforilo, carbonilo e carboxilo poderão ser abordagens interessantes na medida em que também fazem parte da estrutura de fármacos atualmente utilizados. Relativamente aos ensaios biológicos, são necessárias melhorias nos ensaios realizados assim como a realização de ensaios complementares, com o objetivo de permitir esclarecer o mecanismo de ação dos compostos em causa