Characterization of the affective behavioral effects of chronic adolescent exposure to the cannabinoid receptor agonist HU-210 in female rats

Tese de mestrado, Neurociências, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2019Os canabinóides, agonistas dos receptores do sistema endocanabinóide (SEC), são as drogas ilegais mais consumidas no mundo, sendo os adolescentes um dos grupos etários em que o consumo destas substâncias é mais prevalente. A adolescência representa um período crítico do neurodesenvolvimento, no qual o sistema nervoso central é extensamente reorganizado – sendo, também, um período de vulnerabilidade aumentada aos efeitos de influências externas, como por exemplo drogas de abuso. Criticamente, grande parte destas alterações neuronais são mediadas e/ou moduladas pelo SEC sendo, portanto, expectável que o uso de drogas que interagem com esse sistema cause alterações profundas, e possivelmente persistentes, no funcionamento do sistema nervoso. Congruentemente, dados obtidos quer com humanos, quer com roedores, sugerem que a exposição crónica adolescente a canabinóides tem efeitos deletérios quer ao nível da função neurocognitiva, quer ao nível do funcionamento afectivo. Assim, estudos epidemiológicos em populações humanas têm demonstrado que indivíduos adultos, que enquanto adolescentes foram consumidores crónicos de canabinóides, apresentam um risco aumentado de serem diagnosticados com perturbações de ansiedade e/ou perturbações depressivas. Mais ainda, devido a um conjunto ainda não totalmente estudado de factores, este aumento de risco é mais marcado na população do sexo feminino. Em linha com estas observações, estudos experimentais com roedores têm consistentemente demonstrado que a exposição crónica adolescente a canabinóides induz um conjunto profundo e diversificado de alterações a nível molecular, morfológico, estrutural, funcional e comportamental. Em relação ao último, estudos comportamentais têm repetidamente demonstrado que animais adultos expostos a canabinóides durante a adolescência apresentam défices não só em tarefas de função cognitiva, como em testes de função afectiva – apresentando alterações comportamentais que sugerem um efeito prodepressivo desta exposição, que, replicando os dados humanos, é mais marcado em fêmeas. Uma limitação da literatura até agora é, no entanto, o uso de um conjunto limitado de canabinóides. De facto, praticamente todos os estudos usaram apenas uma de três substâncias, o que levanta a possibilidade de existirem outros canabinóides cujos efeitos diferem dos até agora observados, o que – a ser verdade – representaria um problema importante na literatura. O presente trabalho pretende averiguar essa possibilidade, ao estudar o HU-210, um potente agonista total e não-selectivo dos receptores canabinóides 1 (CB1R) e 2 (CB2R). Apesar de este fármaco ser amplamente usado em investigação sobre o SEC, e já ter sido encontrado em substitutos sintéticos de canábis, não existe – à data – nenhum relato publicado acerca do impacto que a exposição crónica adolescente a HU-210 possa ter no funcionamento afectivo. Assim, o presente trabalho consiste num conjunto de quatro experiências desenhadas para caracterizar esses efeitos. Na primeira experiência ratos, Wistar fêmea com 35 dias de idade (PND 35) foram administrados HU-210 diariamente, durante 15 dias, num plano de doses ascendentes (PND 35-39: 25μg/kg; PND 42-46: 50μg/kg; PND 49-53: 100μg/kg, ou solução veiculo equivalente). Após o fim da administração, os animais foram deixados durante 27 dias – de modo a que efeitos residuais, ou resultantes de abstinência, pudessem ser minimizados e permitindo que os animais atingissem a idade adulta – ao fim dos quais foram testados numa bateria de testes comportamentais. Especificamente, para medir alterações ao nível do comportamento ansioso, os animais foram testados no Elevated Plus Maze (EPM; PND 80), Open Field Test (OFT; PND 80 e 81) e Marble Burying Test (MBT; PND 91). Para determinar os efeitos do tratamento no comportamento social foi utilizado o Social Interaction Test (SIT; PND 82). Finalmente, para avaliar os efeitos da exposição a HU-210 nas dimensões de stress-coping e de resposta à recompensa, do comportamento depressivo, os animais foram testados no Modified Forced Swim Test (mFST; PND 85) e no Sucrose Preference Test (SPT; PND 88-91), respectivamente. Adicionalmente, o peso dos animais foi registado ao longo da duração da experiência. Análise dos resultados obtidos revelou que, tal como descrito previamente para outros canabinóides, a exposição a HU-210 não induziu alterações persistentes ao nível do comportamento ansioso, em nenhum dos três testes. Contrariamente ao anteriormente descrito, não foi observada qualquer alteração no SIT, indicando a ausência de efeitos persistentes. No que diz respeito ao comportamento depressivo, foi registado um decréscimo ligeiro no comportamento de trepar, no mFST – sugerindo a possibilidade de alterações de stress-coping – sem qualquer diferença nos outros comportamentos. No SPT não foram encontradas diferenças quer na quantidade de sacarose consumida, quer na preferência relativa por sacarose, indicando que a resposta à recompensa não está alterada. Finalmente, em linha com estudos anteriores, a exposição a HU-210 induziu decréscimos marcados no ganho de peso, que persistiram durante 15 dias após o fim da administração. Dado que os resultados da experiência 1 não foram os esperados, e que várias limitações foram identificadas no protocolo, a experiência 2 foi desenhada para – de novo – testar os efeitos a longo-termo da exposição crónica adolescente a HU-210. Assim, ratos Sprague-Dawley fêmea receberam duas injecções diárias de HU-210 durante 11 dias, seguindo um padrão de doses ascendentes (PND 35-37: 25μg/kg; PND 38-41: 50μg/kg; PND 42-45: 100μg/kg ou veículo equivalente). Após o término da administração, os animais foram deixados em repouso durante 30 dias, ao fim dos quais lhes foi aplicada a mesma bateria de testes comportamentais usada na experiência anterior. Adicionalmente, de modo a determinar os efeitos da exposição adolescente nos níveis de proteína CB1R, amostras de tecido do hipocampo, estriado e córtex pré-frontal, foram recolhidas após o fim da bateria comportamental (PND 88), tendo os níveis de CB1R sido avaliados através de western blotting. Tal como na experiência 1, não foram encontradas quaisquer alterações no comportamento ansioso, ou no comportamento social, e foi observado um decréscimo marcado no ganho de peso que – mais uma vez – persistiu durante 15 dias pós-última administração. No entanto, em contraste quer com a experiência anterior, quer com a literatura, no mFST também não foram observadas alterações. Semelhantemente, no SPT, o desempenho foi igual entre grupos. Em linha com a ausência de alterações comportamentais, não se detectaram alterações nos níveis de proteína CB1R em nenhuma das três regiões estudadas. Dada a discordância entre os resultados obtidos na experiência 2 e o descrito na literatura, a experiência 3 consistiu em avaliar se a administração adolescente de HU-210 tinha de facto algum efeito mensurável a curto-prazo que poderia ter desaparecido, durante o interregno de 30 dias entre a última administração e o início dos testes. Para isso uma nova série de ratos Sprague-Dawley fêmea foi manipulada como descrito na experiência 2, e testada no OFT e mFST, nos dois dias após a última administração de HU-210 (PND 46-47). Adicionalmente, amostras de tecido para western blot foram recolhidas no dia após o fim dos testes comportamentais (PND 48). Surpreendentemente, apesar de nenhuma alteração ter sido encontrada no OFT, no mFST os animais mostraram um padrão comportamental marcado e sugestivo de um efeito antidepressivo do tratamento, com decréscimos no tempo passado em imobilidade e aumentos no tempo passado a trepar. Mais ainda, análise do western blot revelou um decréscimo de cerca de 50% nos níveis de proteína CB1R, na região hipocampal, sem alterações nas restantes. Uma vez que os resultados na experiência 3, no que respeita aos parâmetros do mFST, foram inteiramente inesperados, e as alterações moleculares encontradas foram incongruentes com um efeito antidepressivo, a experiência 4 foi desenhada para mais uma vez avaliar os efeitos imediatos da exposição adolescente a HU-210, recorrendo a outros dois testes, frequentemente usados para testar ansiedade e depressão, o EPM e o SPT, respectivamente. Assim, uma nova série de ratos Sprague-Dawley fêmea foi manipulada como descrito nas experiências 2 e 3, e testada no EPM (PND 46) e SPT (PND 46-49) nos dias que se seguiram à última administração de HU-210. Em linha com o encontrado na experiência 3, não foram observadas alterações no comportamento ansioso no EPM. No entanto, em contraste marcado, no SPT, o grupo tratado com HU-210 consumiu significativamente menos sacarose que os controlos e mostrou, igualmente, um decréscimo acentuado na preferência pela mesma – alterações sugestivas de um efeito prodepressivo. No geral os resultados obtidos ao longo das quatro experiências sugerem que, apesar de o HU-210 ser capaz de induzir alterações marcadas no funcionamento afectivo, estas alterações desaparecem após algum tempo. Mais ainda, o facto deste fármaco não induzir efeitos a longo termo sugere a possibilidade de que diferenças nas características farmacológicas dos vários canabinóides possam ter influência importante e imprevisível, nos resultados observados na literatura. Especificamente, é possível que a ausência de efeitos duradouros após exposição crónica adolescente a HU-210, derive de diferenças farmacodinâmicas deste canabinóide quer ao nível da sua interacção com o SEC, quer ao nível de possíveis interacções com outros sistemas de neurotransmissão/neuromodulação. Assim, a principal conclusão derivada deste trabalho prende-se com a noção de que, ao usar apenas um conjunto limitado de agonistas dos receptores canabinóides, se está a incorrer dois riscos: por um lado, o risco de ignorar a totalidade dos possíveis efeitos da modulação do SEC, e por outro, se formarem conclusões extrapoladas a partir de dados obtidos com vários fármacos diferentes, cuja farmacologia e efeitos podem não ser totalmente comparáveis. Ambos estes riscos têm fortes implicações para a interpretabilidade e utilidade da investigação feita usando canabinóides e acerca do potencial benéfico e/ou deletério da manipulação farmacológica do SEC.Cannabinoids, drugs acting as agonists at the cannabinoid receptors comprising the endocannabinoid system (ECS), are the most widely used illegal drug class in the world, with adolescents being one of the age group where the use of such drugs is most prevalent. Adolescence represents a critical neurodevelopmental period, during which the central nervous system undergoes extensive reorganization, with this development being heavily mediated by the ECS. Thus, it is expectable that the adolescent use of drugs targeting that system will lead to profound, and possibly permanent, alterations in nervous system functioning. Accordingly, both human and rodent studies suggests that chronic adolescent exposure to cannabinoids induces deleterious effects at both the cognitive and affective functioning levels: Epidemiological studies of human populations have shown adults, who were chronic cannabinoid users as adolescents, to be at an increased risk of being diagnosed with both anxiety and/or depressive disorders, with risk being even greater for females. Similarly, rodent experimental studies have consistently demonstrated that chronic adolescent cannabinoid exposure leads to lasting deficits not just in tasks of cognitive function, but in tests of affective functioning, as well – with behavioral alterations suggesting a prodepressant-like effect of cannabinoid treatment which, as in humans, is more marked in females. One limitation of the literature is, however, the overreliance on a limited set of cannabinoids, raising the possibility that other, yet unstudied cannabinoids, may have differing effects from those reported thus far – a significant problem for the field, if true. As such the present work aimed, through four experiments, to test that possibility, by characterizing the affective impact of chronic adolescent exposure to HU-210 – a potent non-selective full-agonist at both cannabinoid receptors 1 (CB1R) and 2 (CB2R) – that, despite being widely used in ECS research, has yet to be studied in this regard. In the first experiment, female Wistar rats aged 35 days (PND 35) were administered HU-210 daily, for a 15-day, in an escalating dosing schedule (PND 35-39: 25μg/kg; PND 42-46: 50μg/kg; PND 49-53: 100μg/kg, or equivalent vehicle solution). Following a 27-day washout period animals were put through a battery of behavioral tests: to assess anxiety-like behavior the Elevated Plus Maze (EPM; PND 80), Open Field Test (OFT; PND 80-81) and Marble Burying Test (MBT; PND 91) were used; to assess social behavior, the Social Interaction Test (SIT; PND 82) was employed; to assess the stress-coping and reward functioning dimensions of depressive-like behavior the Modified Forced Swim (mFST; PND 85) and the Sucrose Preference Tests (SPT; PND 88-91) were used, respectively. Data showed that, as previously described for other cannabinoids, adolescent exposure to HU-210 did not lead to persistent alterations at the level of anxiety-like behavior. However, contrarily to what had been previously described, in the SIT no alteration was observed, suggesting no lasting treatment-induced impairments. With regards to depressive-like behavior, a slight decrease in climbing behavior was observed in the mFST – suggesting the possibility of altered stress-coping – but no changes were found in any of the other behaviors scored. Moreover, no changes were found in the SPT, pointing towards reward functioning being intact. Experiment 2 was designed to again test the long-term effects of chronic adolescent HU-210 exposure, controlling for confounds that may have biased the results of experiment 1. As such, female Sprague Dawley rats, received twice-daily intraperitoneal injections of HU-210 for a period 11-days, following an escalating dosing schedule (PND 35-37: 25μg/kg; PND 38-41: 50μg/kg; PND 42-45: 100μg/kg or equivalent vehicle solution). After a 30-day washout period, animals were tested using the same behavioral testing battery used in the previous experiment. Additionally, so as to determine the effects of exposure on CB1R protein levels, through western blotting, tissue samples were collected from the hippocampus, striatum and prefrontal cortex (PND 88). As was the case in experiment 1, no changes were found in anxiety-like or social behaviors. However, in contrast with both the previous experiment and the literature, no changes were observed in any of the mFST parameters, nor in the SPT. Furthermore, in line with the absence of behavioral alterations, CB1R protein levels were found to be unaltered in all the three brain regions studied. Given the discrepancy between the results obtained in experiment 2 and those described in the literature, experiment 3 was performed so as to determine whether adolescent HU-210 administration did, in fact, have any measurable short-term effect, that might be normalized during washout. To that end a new set of female Sprague-Dawley rats, was manipulated as described in experiment 2, and tested in both the OFT and the mFST, in the two days following the last drug injection (PND 46-47). Additionally, tissue samples for western blotting were collected from the same brain regions (PND 48). Surprisingly, in the mFST animals presented a behavioral pattern suggestive of an antidepressant-like effect of treatment – with decreased in the time spent in immobility and increased time spent climbing. Critically, this effect occurred in the absence of any alterations in the OFT. Moreover, a decrease of approximately 50% in hippocampal CB1R protein levels was observed, with no changes in the remaining regions studied. Since the results of experiment 3 were unexpected, and the molecular alterations observed were incongruous with an antidepressant-like effect, experiment 4 was performed to complement them, by using two other tests: the EPM and the SPT. As such, a new set of female Sprague-Dawley rats was manipulated as described in experiments 2 and 3, and tested in the EPM (PND 46) and SPT (PND 46-49) on the days following the last drug administration. In line with the previous experiment, no alterations were observed in anxiety-like behavior. However, contrastingly, the HU-210-treated group presented markedly decreased sucrose intake and relative sucrose preference, in the SPT – suggesting a prodepressant treatment effect. In general, the results obtained across the four experiments suggest that, despite HU-210 being able to alter affective functioning, these alterations are normalized after sufficient washout time. Moreover, the fact that this drug did not induce long-term effects suggests the possibility that differences in the pharmacological properties of cannabinoids – either in terms of ECS or non-ECS interactions – may influence results observed in the literature, in important and unpredictable ways. As such, the primary conclusion derived from the present work pertains to the notion that, by relying on a limited set of cannabinoid receptor agonists, one may be at risk of ignoring the totality of the possible effects of ECS modulation and of forming possibly erroneous conclusions, extrapolated from data obtained with different drugs, whose pharmacology and effects may not be totally comparable. Both of these risks have strong implications for the interpretability and usefulness of cannabinoid research, and into the beneficial and/or deleterious potential of pharmacological manipulation of the ECS