Structural and functional studies on BEL beta-trefoil, a novel lectin from king bolete (Boletus edulis) mushrooms

Questo lavoro di tesi riguarda la purificazione e la caratterizzazione strutturale di una nuova lectina da funghi porcini. Questa lectina è stata chiamata BEL (Boletus edulis lectin) beta-trefoil e presenta un fold totalmente diverso da quello descritto per le lectine da fungo solubili in soluzione fisiologica. La BEL beta-trefoil è stata studiata approfonditamente dal punto di vista strutturale, determinandone sia la sequenza aminoacidica che la struttura tridimensionale. Questa nuova proteina è costituita da un omodimero in cui ogni monomero è ripiegato secondo il ben noto beta-trefoil fold come si evince dal nome proposto per essa. La lectina è dotata di un evidente effetto antiproliferativo nei confronti di cellule cancerogene umane e questo le conferisce un potenziale terapeutico nella cura dei carcinomi. Per quanto riguarda lo studio strutturale sono state analizzate, mediante diffrazione di raggi X, diverse forme cristalline della proteina in forma apo e numerosi complessi. La migliore forma cristallina della proteina apo raggiunge un limite di risoluzione di 1.12 Å. È stata inoltre analizzata in maniera dettagliata l’interazione della lectina con alcuni carboidrati: lattosio, galattosio, N-acetilgalattosammina e il T-Antigen (Ser-Gal beta1-3GalNAc), il disaccaride responsabile dell’interazione della lectina con le cellule tumorali. La lectina presenta tre siti di legame per gli zuccheri e tutti sono occupati in almeno una forma cristallina. Infine confrontando la struttura della proteina apo con quella dei complessi con gli zuccheri non sono stati osservati cambiamenti conformazionali rilevanti.This thesis deals with the purification and the structural characterization of a novel lectin, completely different from the formerly described members of the saline soluble family of mushroom specific lectins. The lectin was called BEL (Boletus edulis lectin) beta-trefoil and it was purified from the fruiting bodies of king bolete mushrooms, commonly known as porcini. BEL beta-trefoil was structurally characterized: its amino acid sequence and three dimensional structure were determined. The new protein is a homodimer and each protomer folds as a beta-trefoil domain as indicated by the name itself. The lectin has potent anti-proliferative effects on human cancer cells which confers to it an interesting therapeutic potential as an antineoplastic agent. Several crystal forms of the apoprotein and of complexes with different carbohydrates were studied by X-ray diffraction. The structure of the apoprotein was solved at 1.12 Å resolution. The interaction of the lectin with lactose, galactose, N-acetylgalactosamine, the T-antigen disaccharide (Gal beta1-3GalNAc) and the T-Antigen (Ser-Gal beta1-3GalNAc) was examined in detail. All the three potential binding sites present in the beta-trefoil fold are occupied in at least one crystal form. No important conformational changes are observed in the lectin when comparing the structure of the complexes with carbohydrates and those of the ligand free protein