Effekter av spädningsvätska på motilitet och fertilitet hos hingstsperma

At SLU, Divison of Reproduction, Dept of Clinical Science, there is an ongoing project on the development and evaluation of new methods for the assessment of stallion semen quality. This EEF-study, which is a part of that larger project, has focused on the effects on motility and fertility of stallion semen of two different extenders and selection. Both an objective method and a subjective method for analysis have been used and compared in the study. The increase in the use of artificial insemination with cooled semen in Swedish horse breeding over the last decade is thought to play a part in declining foaling rates (Kareskoski et al, 2006, Kuisma et al, 2006). This calls for better evaluation methods of semen quality since cooling and transportation put higher demands on semen quality in order to maintain fertility (Aurich, 2005). Visual assessment by light microscope is a subjective method of sperm motility evaluation and the most common method used in the field. The correlation between fertility and the subjective motility results are not conclusive which has lead to the development of objective methods for semen analysis. The method evaluated in this project is QualispermTM 2008 (Biophos AG, Switzerland) which is a development of CASA (Computer Assisted Semen Analysis). QualispermTM consists of a computer program and a phase light microscope. The images of thousands of spermatozoa are captured via the camera attached to the microscope. These images are digitalized and analyzed for motility, concentration and speed of movment by the computer. In comparison with other CASA-systems QualispermTM analyses a greater number of spermatozoa, is easier to use and cheaper, which make it more suitable for field-practice. The aim of spermatozoal selection is to increase fertility by sifting out spermatozoa that will keep their fertility potential for a longer time. The selection is carried out through "Single Layer Centrifugation" where the spermatozoa travel through a colloid (Morrell et al, 2008). Centrifugation eliminates seminal plasma and decreases the number of spermatozoa. Studies have shown that spermatozoa benefit if some of the seminal plasma is removed (Love et al, 2005, Braun et al, 1994, Kareskoski et al, 2006, MacPherson et al, 2002, Sieme et al, 2004, Waite et al, 2008). The EEF-study was carried out during June 2008 at the national stud at Flyinge, Sweden. Twelve stallions were included in the project, each stallion provided with four or five ejaculates. Aliquots were extended with two different types of extenders; Kenney´s or INRA96, and were analyzed for subjective, objective and progressive motility in fresh and cooled semen before and after selection by centrifugation. Semen was analyzed directly after collection and at 24 and 48 hours after collection. Between the analyses the semen was stored in 5°C. Assessment of motility was made both subjectively by phase contrast microscope and objectively with QualispermTM. The results from QualispermTM also included progressive motility and velocity. The results including selection/non selection were statistically analyzed with SAS (Statistical Analysis Systems Package, version 9, 1 SAS Institute Inc., Cary, N.C., USA, 1989) and both Correlation Procedure and Mixed Procedure were used. The parameters have then been compared with fertility results. Results from both subjective and objective assessment of motility shows that spermatozoa treated with INRA96 extender have higher motility both initially and 24 hours after collection than spermatozoa treated with Kenney´s. The subjective motility assessment also shows that semen extended with INRA96 has a higher motility after 48 hours than semen extended with Kenney´s. The results after selection are consistent with those above; spermatozoa extended with INRA96 have higher motility than spermatozoa treated with Kenney´s. The analysis shows that there was high significant correlation between the subjective and objective assessment methods. Furthermore the results implicate that spermatozoa after centrifugation maintain their motility longer, both with INRA96 and Kenney´s, than spermatozoa that are not selected. Results from the study also suggest that there is a correlation between sperm velocity and pregnancy results. High velocity of spermatozoa yields high percentage of pregnancy. These results agree with results from earlier studies (2005, 2006). Furthermore a comparison between pregnancy results and subjective and objective method of analysis show that the subjective method, in this particular study, is more reliable. To sum up: QualispermTM is an objective method of analysis that need certain adjustments. There still is a subjective element to the method and with consideration of the amount of time the analysis take, the amount of training required, and the sources of error all the above mentioned creates, the method is not usable in practice today. Nevertheless QualispermTM has several advantages to traditional subjective assessment method since the program can analyze more parameters. A further development of QualispermTM could very well increase the applicability of the method for semen analysis in the fieldVid SLU pågår sedan tre år tillbaka ett projekt för att vidareutveckla och utvärdera metoder för kvalitetsbedömning av hingstsperma. Detta examensarbete är en del i ovan nämnda projekt. Examensarbetet har fokuserats kring effekterna av två olika spädningsvätskor på motilitet och fruktsamhet hos hingstspermier. Samtidigt har effekterna av selektion genom centrifugering genom en kolloid studerats. I studien har en objektiv analysmetod använts och utvärderats genom samtidig jämförelse med subjektiv motilitetsbedömning. Syftet med delprojektet har således varit att få ökad kunskap om hur motilitet och fruktsamhet hos hingstsperma påverkas av olika spädningsvätskor och av selektion och på så sätt om möjligt bidraga till att kvalitetskontrollen av hingstsperma utvecklas. Bakgrunden till projektets uppkomst är den ökade användningen av kyld transportsperma för artificiell insemination samtidigt som fölningsprocenten har minskat (Kareskoski et al, 2006, Kuisma et al, 2006). Användningen av kyld transportsperma har ökat på grund av ökad efterfrågan på hingstmaterial. På hingststationerna i Sverige används i dagsläget subjektiv bedömning av motilitet som ett mått på potentiell fruktsamhet. Sambandet mellan motilitet och fertilitet är dock inte säkert och bedömningen av motilitet kan variera mycket mellan olika personer. För att komma till rätta med detta har objektiva metoder för motilitetsbedömning utvecklats. I detta delprojekt har QualispermTM (Biophos AG, Switzerland) använts och utvärderats. QualispermTM är en vidareutveckling av CASA (Computer Assisted Semen Analysis) som är lämplig att använda på hingststation då det är en relativt enkel och billig metod. QualispermTM består av ett dataprogram kopplat till en kamera i ett faskontrastoptikmikroskop. Tusentals spermier kan analyseras genom att QualispermTM fotograferar spermierna då de rör sig genom olika fält. Bilderna digitaliseras och med hjälp av dessa data kan QualispermTM analysera spermiekoncentration, motilitet och hastighet. Spermierna delas upp i fyra undergrupper beroende på rörelsemönster och hastighet. Genom selektion av sperma hoppas man kunna få fram spermier som bibehåller sin fruktsamhetspotential längre tid och på så sätt höja fertiliteten. Selektionen sker genom att spermierna centrifugeras genom en kolloid s.k. ”Single layer centrifugation” (Morrell, Johannisson et al, 2008). Genom centrifugering fås samtidigt en minskning av antal spermier. Detta kan, men behöver inte vara ett problem; genom att få fram spermier av bättre kvalitet kan inseminationsdosen eventuellt minskas. I Sverige idag ligger en inseminationsdos vid användning av färsk sperma på ungefär 500 miljoner motila spermier, med transportsperma på 1 miljard motila spermier och vid användning av fryst sperma varierar dosen (Nie et al, 2002, Dalin, A-M., Malmgren, L. 2004, s176-177). Den praktiska delen av denna delstudie genomfördes på Flyinge hingststation under juni 2008. Totalt ingick 12 hingstar och från dessa undersöktes 4-5 ejakulat per hingst. Sperman späddes med två olika spädningsvätskor, Kenney´s eller INRA96, varefter den undersöktes avseende bl.a. motilitet både före och efter selektion. Selektionen skedde genom centrifugering (Single Layer Centrifugation). Sperman analyserades vid tre tidpunkter; 0, 24 och 48 timmar efter samling. Bedömning av motilitet skedde både subjektivt med hjälp av ljusmikroskop och objektivt med hjälp av QualispermTM. Den statistiska analysen bestod i att jämföra subjektiv, objektiv och progressiv motilitet, förändringar i motilitet efter kylförvaring i 24 och 48 timmar och skillnader i motilitet beroende på vilken spädningsvätska som använts. Även skillnader mellan olika hingstar och vilken roll selektion spelat undersöktes. Dessa parametrar har sedan jämförts med dräktighetsresultat. Resultaten från både den subjektiva och objektiva motilitetsbedömningen tyder på att spermier som får en tillsats av INRA96 har en högre rörelseförmåga än de spermier som späds med Kenney’s. Den statistiska analysen visar att korrelationen mellan de olika metoderna för motilitetsbedömning är hög och att de skillnader som föreligger är statistiskt signifikanta. Betydelsen av selektion genom centrifugering har utvärderats i studien och resultaten tyder på att centrifugering gör att spermierna bibehåller en större rörelseförmåga, såväl vid spädning med INRA96 som med Kenney´s spädningsvätska. Resultaten visar även att en viss korrelation finns mellan spermiernas hastighet och dräktighetsresultatet. Dessutom föreligger en ganska hög korrelation mellan dräktighetsprocent för AI (färsk sperma) och progressiv motilitet hos färsk sperma. Resultaten talar även för att subjektiv analys metod är mer tillförlitlig än objektiv analysmetod. QualispermTM är en objektiv analysmetod som, med tanke på den tid det tar att utföra analysen, den träning som krävs och den subjektivitet som fortfarande föreligger samt de felkällor som ovan nämnda parametrar medför, i dagsläget inte lämpar sig för praktisk tillämpning på en hingststation. Dock har QualispermTM flera fördelar jämfört med traditionell subjektiv motilitetsanalys då den analyserar fler parametrar. En vidareutveckling av QualispermTM kan mycket väl innebära att metoden blir tillämpbar även i den praktiska verksamheten