Serum free triiodothyronine (FT3) as a marker of inflammation in chronic hemodialysis patients: correlation of serum freeT3 with CRP and IL-6 levels respectively

A number of recent studies have postulated that end stage renal disease patients receiving hemodialysis as a treatment can serve as a unique model of non-thyroidal illness syndrome. In reverse, it has been suggested that disarrangements in thyroid function can have a prognostic impact in hemodialysis patient’s survival. Indeed, recent studies have proposed a possible link between freeT3 and inflammation in hemodialysis, while other investigators postulated a connection between low freeT3 and the cardiorenal syndrome. The main pathogenetic mechanisms of non thyroidal illness syndrome in chronic inflammation, including end stage renal disease patients, seem to involve iodine retention, alterations to protein binding, derangements to deiodinases activity and dysregulation at the hypothalamic level, although most of them are still unclear. More recent studies gave evidence that the NTIS is an acute phase response, yielded by activation of a cytokine network. In such studies, interleukin-6, among others, inversely correlated with serum T3 levels. On the other hand, there are well established markers of inflammation, like CRP and IL-6, which have been closely linked with survival in ESRD patients. One well examined model of action is the high energy waste along with chronic inflammation and atheromatosis that hemodialysis patients are prone to. Moreover, recent studies focus on the low-grade inflammation, a common feature of the uremic environment. So it seems rather appealing to investigate these common pathways and prove a possible causality between low T3 syndrome and chronic inflammation in ESRD patients. Until the design of the present thesis, there were only few studies dealing with the search of a possible relationship between low freeT3 and chronic inflammation state in the uremic environment or its use as a prognostic marker for hemodialysis patients.Thus, the aim of this study was to explore a probable relationship between freeT3 and chronic low grade inflammation in a population of ESRD patients undergoing hemodialysis in Northern Greece, which encompasses several distinguishable features in terms of environmental and genotype characteristics, while also the diversity of treatment conditions. We examined the possible consequences of low freeT3 not as metabolic derangement in hemodialysis patients but as part of the puzzle of chronic low grade inflammation that outlines the uremic environment, through the rationale and mechanisms of low T3 or non thyroidal illness syndrome. Our thesis focused in the potent relationship of freeT3 with two established biomarkers of chronic inflammation, namely hsCRP and IL-6. Furthermore, as chronic inflammation seems to correlate independently with survival in ESRD patients treated with hemodialysis, we also prospectively examined a potential association of low plasma freeT3 with survival, while also with the incidence of new cardiovascular disease events. 117 patients consecutively entered the study with a total duration of 84 months. Among them 86 were male and 31 female patients with a mean age of 62.29±14.35 years. The sum of the patients received treatment in two large hemodialysis centers in Northern Greece, the Hemodialysis Unit of University Hospital in Alexandroupolis and the Hemodialysis Unit of “G.Papanikolaou” General District Hospital. All patients had been stabilized on renal replacement therapy for >3 months prior to enrollment (mean HD duration 113.4±65.1 months) and were clinically stable and free of active infection. Patients with known history of thyroid disorders or taking medications with possible effect in thyroid hormone values, like amiodarone or lithium, were excluded from the study.The sampling period involved three blood collections at the first of the month for three consecutive months in order to measure thyroid parameters (freeT3, freeT4 and TSH) and inflammatory markers, hsCRP and IL-6. At the same time, full blood count and biochemical parameters, like urea, creatinine, albumin and total protein, total cholesterol and triglycerides, were recorded from the monthly routine laboratory check of each patient. Adequacy of dialysis was calculated by the second generation Daugirdas equation of Kt/V and just for the first month. Anthropometric parameters like height, dry body weight and hence body mass index (BMI), were carefully recorded. In addition, we reviewed the medical files of each patient in order to record any history of hypertension, diabetes mellitus, smoking or cardiovascular disease. Blood pressure (BP) was measured in a supine position after 15 min of recumbency before a routine midweek dialysis session. Finally, hemodialysis (HD) modality, type of dialyzer, HD time and the type and status of vascular access, were also recorded. Serum thyroid parameters (free T3, freeT4, TSH), were measured by chemiluminescent, immunometric assays. Serum CRP levels were measured by high sensitivity nephelometry, while serum interleukin-6 (IL-6) concentrations were measured by sandwich ELISA immunoassay using commercially available standard kits.During follow up (81 months), deaths from all cause were recorded, while also the incidence of new CVD events. History of cardiovascular disease was defined as history of myocardial infarction, coronary artery bypass or clinical signs of angina pectoris, stroke or transient ischemic attack or peripheral vascular disease.In analyzing our results, we used two models of patient grouping. In the first model patients were dichotomized in groups of normal or low freeT3 based on our laboratory lower cut off value of 1.8 pg/mL. In the second model patients were divided in groups regarding the variation of freeT3 values during the three months of the sampling period. Four groups were formed, the one with patients having stable low freeT3 values, the second with patients that had stable normal values and the remaining two groups involved patients either with increases or decreases in the values of freeT3.Discussing our results, our data confirmed the high prevalence of low T3 syndrome among hemodialysis patients, which in our study was detected in 30% of the patients. Eventually, we only found a trend of correlation between freeT3 and inflammatory markers. More specific, bivariate analysis revealed significant correlations between hsCPR and freeT3 (Spearman’s rho= -0.323, p=0.001), TSH and freeT4 (Spearman’s rho= -0.259, p=0.010), and hsCRP and IL-6 (Spearman’s rho= 0.312, p=0.001). These associations remained significant in the following two months except from the correlation between hsCRP and freeT3. IL-6 did not seem to correlate with freeT3. Interestingly, serum albumin showed a strong correlation with freeT3, for April (Spearman's rho=0.3, p=0.001) and May (Spearman's rho=0.239, p=0.012), respectively. Finally, a linear statistically significant association between age and mean freeT3 was noted, which in our study population resulted in the following algorithm: Mean freeT3=2,80-0,01*Age.The basic demographic characteristics of the study population where typical of the Greek hemodialysis population according to the local registries.Regarding survival analysis, at least in the model where patients were dichotomized in low and normal freeT3 groups, low levels of freeT3 showed a clear survival deficit in hemodialysis patients [Kaplan-Meier, (log rank=6.3, p=0.002)]. Even in multivariate regression analysis with known confounders like age, DM, hypertension, hsCRP and creatinine, the presence of low freeT3 remained a significant, independent predictor of death among hemodialysis patients. However, in a multivariate stepwise Cox regression analysis, including also hemoglobin, dialysis vintage and history of CVD event, plasma freeT3 lost significance for prediction of all cause mortality. Indeed, in a fully adjusted model, factors independently associated with survival were age (3.2% higher odds of death for every year), history of CVD event (83.5% likelihood of death), dialysis vintage and hemoglobin. Moreover, for every 1g/dL of raise in hemoglobin there was a risk reduction for mortality of 43% and for every month a person was treated with hemodialysis there was a mild risk reduction of 0.9% for the overall 7-year mortality. The latter propably emerged due to a spurious relationship between freeT3 and HD vintage. In conclusion, in a study of patients on maintenance hemodialysis in Northern Greece, plasma freeT3 was not found to correlate strongly with two established markers of inflammation, namely hsCRP and IL-6. Assuming low freeT3 as part of non-thyroidal illness syndrome, while hsCRP and IL-6 as markers of low grade chronic inflammation in the uremic environment, no strong association was established. It is worth mentioning that not all previous studies that confirmed an association between low freeT3 and inflammation, actually used hsCRP, although it seems more sensitive in the detection of low grade chronic inflammation in ESRD.Nevertheless, in survival analysis low freeT3 emerged as an independent predictor of death, both in a univariate and a multivariate model.However, more prospective trials are required in the field of lowT3 syndrome among hemodialysis patients, in order to discuss potential therapeutic interventions or so as to adopt freeT3 as a strong prognostic marker for hemodialysis patients.Σύγχρονες μελέτες εικάζουν ότι οι ασθενείς με τελικό στάδιο χρόνιας νεφρικής νόσου που υποβάλλονται σε αιμοκάθαρση, προσφέρουν ένα ιδανικό μοντέλο του γνωστού στη διεθνή βιβλιογραφία συνδρόμου χαμηλής Τ3. Αντιστρόφως, έχει προταθεί ότι οι μεταβολές στη θυρεοειδικη λειτουργία έχουν δυνητικά προγνωστική αξία για τη θνητότητα των ασθενών υπό αιμοκάθαρση. Μάλιστα, πρόσφατες έρευνες υπέδειξαν τη συσχέτιση μεταξύ της freeT3 και της χρόνιας φλεγμονής στην αιμοκάθαρση, ενώ άλλες υπέθεσαν τη σύνδεση του συνδρόμου χαμηλής T3 και του καρδιονεφρικού συνδρόμου.Αναφορικά με τους κύριους παθογενετικούς μηχανισμούς του συνδρόμου μη θυρεοειδικής νόσου στη χρόνια νόσο, που αφορούν και το τελικό στάδιο χρόνιας νεφρικής νόσου, φαίνεται να εμπλέκονται η κατακράτηση ιωδίου, αλλαγές στη δεσμευτική ικανότητα διαφόρων πρωτεϊνών, μεταβολές στη δραστηριότητα των αποϊωδινασών και διαταραχές σε υποθαλαμικό επίπεδο, αν και δεν έχουν διευκρινιστεί πλήρως. Πιο πρόσφατες έρευνες, ανέδειξαν το ΣΜΘΝ ως μια διεργασία απάντησης οξείας φάσης, που πυροδοτείται από την ενεργοποίηση ενός δικτύου κυτοκινών. Σε αυτές τις μελέτες μάλιστα, η IL-6 φάνηκε να συσχετίζεται αρνητικά με τα επίπεδα της Τ3 στο πλάσμα. Από την άλλη μεριά, υπάρχουν αναγνωρισμένοι δείκτες φλεγμονής, όπως η CRP και η IL-6, οι οποίοι έχουν συσχετισθεί με τη συνολική επιβίωση των ασθενών υπό αιμοκάθαρση. Ένα γνωστό μοντέλο δράσης είναι το αυξημένο ενεργειακό έλλειμμα και η χρόνια φλεγμονή σε συνδυασμό με τα υψηλά ποσοστά αθηρωμάτωσης που εμφανίζουν οι αιμοκαθαιρόμενοι. Επομένως, φαίνεται αρκετά ενδιαφέρον η διερεύνηση κοινών μηχανισμών δράσης ή ακόμη και μια αιτιολογική συσχέτιση μεταξύ του συνδρόμου χαμηλής Τ3 και της χρόνιας φλεγμονής στην αιμοκάθαρση. Μέχρι το σχεδιασμό αυτής της διατριβής ελάχιστες ήταν οι μελέτες που ασχολήθηκαν με την ανίχνευση μιας πιθανής σχέσης της χαμηλής freeT3 με τη χρόνια φλεγμονή που χαρακτηρίζει το ουραιμικό περιβάλλον και ειδικότερα με την χρήση της σαν ανεξάρτητο προγνωστικό δείκτη επιβίωσης στην αιμοκάθαρση. Σκοπός λοιπόν της παρούσας μελέτης αποτέλεσε η διερεύνηση της πιθανής σχέσης της ελεύθερης τριϊωδοθυρονίνης ορού με τη χρόνια φλεγμονή σε έναν πληθυσμό αιμοκαθαιρομένων ασθενών στη Βόρειο Ελλάδα, με τις πιθανές ιδιαιτερότητες σε γενετικές και περιβαλλοντικές μεταβλητές, καθώς και στα χαρακτηριστικά και τις συνθήκες αιμοκάθαρσης στην Ελλάδα.Αναζητήσαμε τις πιθανές επιδράσεις της χαμηλής freeT3 στους αιμοκαθαιρόμενους όχι ως στοιχείο θυρεοειδικής νόσου με τις γνωστές μεταβολικές συνέπειες, αλλά σαν δείκτη συσχέτισης με τη χρόνια χαμηλού βαθμού φλεγμονή που χαρακτηρίζει το ουραιμικό περιβάλλον, ως μια διάσταση του γνωστού στη διεθνή βιβλιογραφία συνδρόμου χαμηλής Τ3 – μη θυρεοειδικής νόσου (NTIS). Ειδικότερα η υπόθεση μας στηρίχθηκε στη διερεύνηση μιας πιθανής αλληλεπίδρασης της freeT3 με δύο ευρέως χρησιμοποιούμενους δείκτες, οι οποίοι σχετίζονται με τη χρόνια φλεγμονή στην αιμοκάθαρση, την IL-6 και τη hsCRP. Λαμβάνοντας μάλιστα υπόψη, την ισχυρή προγνωστική αξία της χρόνιας φλεγμονής στη συνολική επιβίωση των ασθενών υπό αιμοκάθαρση, σε προοπτική μελέτη διερευνήθηκε επίσης η συσχέτιση της freeT3 με την πρόγνωση για θάνατο από κάθε αιτία, καθώς και με την εμφάνιση καρδιαγγειακών επεισοδίων. Στη μελέτη ( συνολικής διάρκειας 84 μηνών), πήραν μέρος αρχικά 117 άτομα, 86 άνδρες και 31 γυναίκες, με μέση τιμή ηλικίας 62,29 ± 14,35 έτη, οι οποίοι υποβάλλονταν σε αιμοκάθαρση σε δύο μεγάλα κέντρα αιμοδιύλισης της Βόρειας Ελλάδας, τη ΜΤΝ του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Αλεξανδρούπολης και τη ΜΤΝ του Γ.Π.Ν «Γ.Παπανικολάου» Θεσσαλονίκης. Οι συμμετέχοντες έπρεπε να είναι σταθεροί, χωρίς βαρειά υποκείμενη παθολογία, όπως καρκίνο τελικού σταδίου, μείζονα χειρουργική επέμβαση ή σοβαρή λοίμωξη που να χρήζει νοσηλεία, ενώ απαραίτητη συνθήκη ήταν να έχουν ενταχθεί σε χρόνιο πρόγραμμα αιμοκάθαρσης για >3 μήνες (μέση διάρκεια θεραπείας 113.4±65.1 μήνες). Από τη μελέτη αποκλείστηκαν οι ασθενείς με γνωστό ιστορικό θυρεοειδοπάθειας, ανεξάρτητα από τη λήψη ή όχι φαρμακευτικής αγωγής Το πειραματικό στάδιο περιελάμβανε τη λήψη δειγμάτων αίματος σε τρείς συνεχόμενους μήνες, για τη μέτρηση των θυρεοειδικών παραμέτρων (freeT3, freeT4, TSH) και των φλεγμονωδών δεικτών CRP και IL-6. Παράλληλα για τους τρείς μήνες της δειγματοληψίας καταγράφονταν από τους ιατρικούς φακέλους των ασθενών τα στοιχεία από το μηνιαίο αιματολογικό και βιοχημικό έλεγχο ρουτίνας και συγκεκριμένα η ουρία, η κρεατινίνη, τα ολικά λευκώματα, η αλβουμίνη, η ολική χοληστερόλη, τα τριγλυκερίδια, τα λευκά αιμοσφαίρια και ο τύπος τους, ο αιματοκρίτης και η αιμοσφαιρίνη. Τον πρώτο μήνα υπολογιζόταν και η επάρκεια της κάθαρσης με το γνωστό τύπο του Daugirdas για Kt/v. Ο ανθρωπομετρικός έλεγχος περιελάμβανε τη μέτρηση του ύψους, την όσο το δυνατόν ακριβέστερη καταγραφή του ξηρού βάρους και βάσει αυτών των στοιχείων τον υπολογισμό του δείκτη μάζας σώματος. Από το ατομικό αναμνηστικό των ασθενών καταγραφόταν επίσης το ιστορικό ΣΔ, αρτηριακής υπέρτασης, καπνίσματος και γνωστού ιστορικού καρδιαγγειακού επεισοδίου. Η καταμέτρηση της συστολικής και διαστολικής αρτηριακής πίεσης γινόταν σε ύπτια θέση πριν την αιμοκάθαρση. Τέλος, καταγραφόταν και η μέθοδος αιμοκάθαρσης, το φίλτρο, η διάρκεια αιμοκάθαρσης, καθώς και ο τύπος και η κατάσταση της αγγειακής προσπέλασης. Για τις παραμέτρους της θυρεοειδικής λειτουργίας, freeT3, freeT4 και TSH χρησιμοποιήθηκαν ανοσομετρικές μέθοδοι χημειοφωταύγειας. Για τη CRP επιλέχθηκε ο προσδιορισμός της συγκέντρωσής της στον ορό με νεφελομετρική μέθοδο μέγιστης τιμής (peak rate nephelometry), υψηλής ευαισθησίας. Τέλος για την IL-6 επιλέχθηκε η μέθοδος μέτρησης με ανοσοενζυμική μέθοδο ELISA, τύπου “sandwich”.Κατά τη διάρκεια της περιόδου παρακολούθησης καταγράφηκαν οι θάνατοι από κάθε αιτία, καθώς επίσης και η εμφάνιση νέων καρδιαγγειακών επεισοδίων. Η διάγνωση της καρδιαγγειακής νόσου ορίστηκε από την παρουσία μίας από τις παρακάτω κλινικές εκδηλώσεις: στεφανιαία νόσος, αγγειακό εγκεφαλικό επεισόδιο ή περιφερική αγγειακή νόσοςΓια την ανάλυση των αποτελεσμάτων χρησιμοποιήθηκαν δύο μοντέλα. Στo πρώτο οι ασθενείς διχοτομήθηκαν σε ομάδες φυσιολογικής και χαμηλής freeT3, ανάλογα με το μέσο όρο των τιμών κατά τους τρείς μήνες της δειγματοληψίας και με βάση το χαμηλότερο φυσιολογικό όριο της freeT3, που ήταν 1.8 pg/mL. Στο δεύτερο μοντέλο οι ασθενείς χωρίστηκαν σε τέσσερις ομάδες ανάλογα με τη διακύμανση των τιμών της freeT3 κατά τους τρείς μήνες, δηλαδή σε αυτούς με σταθερά χαμηλή freeT3 (<1.8 pg/mL), σε αυτούς με σταθερά φυσιολογική freeT3 και σε αυτούς που παρουσίαζαν είτε αύξηση είτε μείωση των τιμών της freeT3.Καταρχήν από την ανάλυση των αποτελεσμάτων επιβεβαιώθηκε το υψηλό ποσοστό του συνδρόμου χαμηλής Τ3 σε ασθενείς υπο αιμοκάθαρση, που στη μελέτη μας ανερχόταν περίπου στο 30%. Απο τα αποτελέσματα της μελέτης, προέκυψε μια μικρή συσχέτιση, περισσότερο μια τάση συσχέτισης μεταξύ της freeT3 και των φλεγμονωδών δεικτών. Ειδικότερα, απο την ανάλυση των διμεταβλητών συσχετίσεων, σημαντική συσχέτιση παρουσίασαν κατά την έναρξη της μελέτης, η CRP με την freeT3 (Spearman's rho= -0.307, p=0.001), η CRP με την IL-6 (Spearman's rho=0.312, p=0.001) και η TSH με την freeT4 (Spearman's rho= -0.195, p=0.037). Οι ανωτέρω συσχετίσεις παρέμειναν σημαντικές και στους υπόλοιπους μήνες (Μάιος, Ιούνιος), εκτός απο αυτή της CRP με τη freeT3. Σε αντίθεση με τη CRP, η IL-6 δεν συσχετίσθηκε με τη freeT3 σε κανένα από τα στατιστικά μοντέλα.Επίσης επιτεύχθηκε η ανίχνευση μια γραμμικής στατιστικά σημαντικής συσχέτισης μεταξύ της freeT3 και της ηλικίας των ασθενών, που στον πληθυσμό της μελέτης εκφράστηκε με τον αλγόριθμο: Μέση freeT3=2,80-0,01*[Ηλικία]. Είναι αξιοσημείωτο επίσης ότι η λευκωματίνη παρουσίασε μια σταθερή συσχέτιση με την freeT3 (Spearman's rho=0.3, p=0.001) και (Spearman's rho=0.239, p=0.012) για Απρίλιο και Μάιο αντίστοιχα.Όσον αφορά τα επιδημιολογικά και κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών στη μελέτη, φαίνεται ότι είναι αντιπροσωπευτικά του πληθυσμού των αιμοκαθαιρομένων στη Βόρειο Ελλάδα.Αναφορικά με τη μελέτη επιβίωσης, στο μοντέλο όπου διχοτομήθηκαν οι ασθενείς με βάση τις μέσες τιμές, η χαμηλή freeT3 εμφάνισε μια ξεκάθαρη θετική συσχέτιση με την πρόγνωση για θάνατο στην καμπύλη επιβίωσης Kaplan-Meier (log rank=6.3, p=0.002). Ακόμη και όταν χρησιμοποιήθηκε πολυπαραγοντική ανάλυση με τη συμμετοχή της ηλικίας, του ΣΔ, της υπέρτασης, της hsCRP και της κρεατινίνης, η freeT3 παρέμενε ισχυρός και ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης της θνητότητας των αιμοκαθαιρομένων. Βέβαια, στο πολυπαραγοντικό μοντέλο stepwise γραμμικής παλινδρόμησης, όπου συμμετείχαν όλοι οι πιθανολογούμενοι συγχυτικοί παράγοντες επιβίωσης, ανάμεσά τους και το ιστορικό καρδιαγγειακών επεισοδίων, βρέθηκε ότι η χαμηλή freeT3 έχανε την προγνωστική της ικανότητα για την επιβίωση. Σε αυτό το μοντέλο ανάλυσης, η ηλικία βρέθηκε να επηρεάζει σημαντικά τη θνητότητα, καθώς για κάθε χρόνο η πιθανότητα θανάτου αυξανόταν κατά 3.2%. Επίσης το ιστορικό καρδιαγγειακής νόσου αναδείχθηκε σημαντικός προγνωστικός παράγοντας (83.5% πιθανότητα για θάνατο). Ακόμη η τιμή της αιμοσφαιρίνης βρέθηκε στατιστικά σημαντική, καθώς για κάθε 1 gr/dl αύξησης της τιμής της ο κίνδυνος για θάνατο μειωνόταν κατά 43%. Επιπροσθέτως, από την ανάλυσή των αποτελεσμάτων, καταγράφηκε μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ της συνολικής διάρκειας που οι ασθενείς ελάμβαναν θεραπεία υποκατάστασης και της επιβίωσης. Για κάθε μήνα που ένας ασθενής υποβαλλόταν σε αιμοκάθαρση ο σχετικός κίνδυνος θανάτου μειωνόταν κατά 0.9% (HR=0.991, 95%CI 0.98-0.99, p