A new target for the therapy of squamous cell carcinoma: inhibition of human DNA polymerase alpha

Titelblatt und Inhaltsverzeichnis Einleitung Materialien und Methoden Ergebnisse Diskussion Zusammenfassung Literaturverzeichnis AnhangDie Inzidenz der Aktinischen Keratose, des Plattenepithelkarzinoms sowie des Basalioms ist in den letzten Jahren v.a. aufgrund eines veränderten Sonnenverhaltens der Bevölkerung stark angestiegen. Pol α, das Schlüsselenzym der DNA Replikation, ist ein interessantes und vielversprechendes Target zur Therapie dieser Krebsformen. Erstmals wurden mit Hilfe eines 3D-Modells des aktiven Zentrums der Pol α Inhibitoren für dieses Enzym rational entwickelt. Zwei vielversprechende Kandidaten wurden in vielfältigen Untersuchungen hinsichtlich ihrer Toxizität auf primäre Keratinozyten, HaCaT-Zellen und SCC-25 Zellen im Vergleich zu Referenzsubstanzen (Aphidicolin, 5-FU) untersucht. Hierbei erwiesen sich HaCaT-Zellen aufgrund ihrer vergleichsweise starken Proliferationsrate allerdings als wenig geeignet. Für die Wirkung der Testsubstanzen ist eine Aufnahme in die Zelle und eine anschließende Aktivierung der Nukleosid-Analoga zu den entsprechenden Triphosphaten erforderlich. In dieser Arbeit wurden erstmals bei primären sowie transformierten Keratinozyten und SCC-25 Zellen die Expression der Transporter hENT-1, MRP4 und MRP5 sowie der Enzyme dCK, dGK, TK-1 und TP nachgewiesen. Sowohl primäre Keratinozyten als auch HaCaT-Zellen exprimieren alle untersuchten Transporter und Enzyme. SCC-25 Zellen dagegen exprimieren den Transporter hENT-1 und das Enzym dCK kaum. Ob oder in welchem Ausmaß dieser Transporter und die dCK für die Aufnahme und Aktivierung der hier entwickelten Polymerase Inhibitoren notwendig ist, bleibt zu klären. Möglicherweise bedeutet das Fehlen der dCK, dass das entwickelte Guanosin Analogon in den Mitochondrien und nicht im Zellkern aktiviert wird. Die anionischen Auswärtstransporter MRP4 und MRP5 können bei Überexpression Resistenzen verursachen. In den hier untersuchten Zellen waren die Transporter allerdings nicht überexprimiert, so dass ihr Einfluss nicht endgültig geklärt werden konnte. Die beiden entwickelten Inhibitoren erwiesen sich in den Zytotoxizitätstests als wirksam und bestätigen damit grundsätzlich das gewählte Target der DNA Pol α Hemmung zur Therapie des hellen Hautkrebses. Allerdings müssen noch weitere Vertreter geschaffen werden, die diese ersten Inhibitoren in Wirksamkeit und Selektivität übertreffen. Als zusätzlicher Angriffspunkt wurde die Angiogenesehemmung durch Calcitriol untersucht. Calcitriol auch in Kombination mit DEX hemmt das Tumorwachstum direkt und indirekt durch Hemmung der Angiogenese. In den hier untersuchten Zellen (SCC-25, HBMEC) konnte diese zytotoxische Wirkung nicht gezeigt werden. Die Summe der Ergebnisse, sowohl zum Expressionsmuster der untersuchten Zellen als auch zum Zytotoxizitätsprofil der synthetisierten Substanzen, liefert wichtige Erkenntnisse für die Strukturoptimierung für weitere Wirkstoffkandidaten. Zudem erlaubt die breite Evaluierung von Toxizitätstests in Zukunft die gezielte Auswahl eines Tests entsprechend der Fragestellung und der Molekülstruktur.The incidence of actinic keratosis, squamous cell carcinoma as well as basal cell carcinoma has risen during the last decades primarily because of an increased exposure to UV radiation of the population. Pol α, the key enzyme in DNA replication, is an interesting and promising target for the therapy of skin cancer. For the first time inhibitors of the pol α were developed rationally by means of a 3D model of the active center of the enzyme. Two promising candidates were tested diversely regarding their toxicity in primary keratinocytes, HaCaT cells and SCC-25 cells in comparison to reference substances (aphidicolin, 5-FU). However, HaCaT cells dividing relatively rapidly did not prove suitable as model cells for normal keratinocytes. To become active, the substances have to be taken up into the cell and consequently activated to their respective triphosphates. In the course of this work the expression of the transporters hENT-1, MRP4 and MRP5 as well as the enzymes dCK, dGK, TK-1 and TP was first described for primary and transformed keratinocytes and SCC-25 cells. Primary keratinocytes as well as HaCaT cells express all transporters and enzymes tested. However, SCC-25 cells hardly express the transporter hENT-1 or the enzyme dCK. Yet, if the transporter and the enzyme are necessary for the uptake and the activation of the polymerase inhibitors at all or to which extend has still to be elucidated. It might be possible, that the guanosine analogue is activated in the mitochondria and not in the nucleus. The anionic outward transporters MRP4 and MRP5 can cause resistance in cells overexpressing these transporters. In the cells analyzed the two transporters were poorly expressed and therefore their influence could not finally be determined. The two developed pol α inhibitors proved effective in the diverse cytotoxicity tests and thereby proved the chosen target of inhibition of DNA pol α for the therapy of squamous cell carcinoma. However, it will be necessary to develop further candidates, which supersede these primary inhibitors in potency and selectivity. Moreover, the possibility of a dual attack targeting angiogenesis was evaluated. Calcitriol also in combination with DEX is a known and widely tested agent which inhibits tumor growth directly and indirectly via inhibition of angiogenesis. However, with the cells investigated here, i.e. SCC-25 cells and HBMEC, no such toxic effect could be detected. The sum of the results, regarding the expression of the different transporters and activating enzymes in the cells as well as the cytotoxicity profiles of the synthesized substances, gives important information for the structural improvement of further analogues. Moreover, the broad spectrum of cytotoxicity tests which was evaluated allows to distinctly choosing a test protocol fitting to the structure of new substances and the aspect of interest