Polysulfated dendrons as drug delivery systems for enzymes in cancer therapy

Einleitung: Klassische Chemotherapeutika sind aufgrund ihrer oft unzureichenden Selektivität durch eine hohe systemische Toxizität gekennzeichnet. Durch einen gezielten Transport könnten die systemischen Nebenwirkungen gesenkt und der therapeutische Effekt verbessert werden. Dendritische Polymere können als effiziente Targeted Drug Delivery Systeme (TDDS) verwendet werden. Das MacroDel (Macromolecular Delivery), ein synthetisches, polysulfatiertes, monodisperses Polyglycerol, soll in der vorliegenden Arbeit als Transportmolekül für Enzyme untersucht werden. Enzymatisch aktive Substanzen werden aufgrund der fehlenden Möglichkeit sie gezielt an ihren Wirkort zu transportieren, selten als Zytostatika eingesetzt. Sie besitzen jedoch ein hohes zytotoxisches Potential. Am Beispiel von RNase, DNase und Asparaginase soll untersucht werden, ob sich das MacroDel als Transportvehikel für Enzyme in der Tumortherapie eignet. Methoden: Die Enzyme wurden an das MacroDel konjugiert. Der Kopplungserfolg wurde über eine native Gelelektrophorese geprüft und die enzymatische Aktivität nach Konjugation mittels Photometrie gemessen. Die Aufnahme und Verteilung des MacroDels und der MacroDel-Enzym Konjugate wurde in vitro auf sämtliche Tumorzelllinien über Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Dafür wurden das MacroDel und die MacroDel-Enzym Konjugate an einen ICC-Farbstoff konjugiert. In vivo erfolgte die Analyse auf Nude-Fox1nu Mäusen, denen das humane Kolonkarzinom HT29 und ein gastropankreatischer Tumor implantiert wurde. Die Zytotoxizität wurde in vitro mittels MTT-Tests analysiert. Der Nachweis der transportervermittelten Aufnahme des MacroDels und der MacroDel-Enzym Konjugate erfolgte durch die Inhibierung von OATP1B1 mit Rifamycin. Ergebnisse: Es konnte gezeigt werden, dass die Konjugierung der Enzyme an das MacroDel ohne wesentlichen Aktivitätsverlust möglich ist. Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass das MacroDel und die MacroDel-Enzym Konjugate von allen getesteten Tumorzelllinien in vitro zytoplasmatisch aufgenommen werden und in vivo im Tumor akkumulieren. Ihre Aufnahme konnte durch einen OATP- Transporter Inhibitor gehemmt werden. Zudem konnten das MacroDel und die MacroDel-Enzym Konjugate in vitro auf einigen Tumorzelllinien zytotoxische Effekte hervorrufen. Zusammenfassung: In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass das MacroDel gezielt Enzyme ins Tumorgewebe transportieren kann. Weiterhin werden das MacroDel und die MacroDel-Enzym Konjugate wahrscheinlich über Transporter direkt ins Zytoplasma von Tumorzellen aufgenommen. Das MacroDel stellt somit eine vielversprechende Wirkstoffgruppe dar, die als Targeted Drug Delivery System für Enzyme in der Tumortherapie weiter untersucht werden sollte. Das MacroDel könnte aufgrund seiner direkten zytoplasmatischen Aufnahme, das Targeting vieler neuer intrazellulärer Strukturen ermöglichen.Introduction: Conventional chemotherapeutic drugs are mostly associated with high systemic cytotoxicity because of their low selectivity. Selectivity can be increased by the use of targeted drug delivery systems which lead to lower side effects and better therapeutic outcomes. Dendritic polymers have shown to be promising targeted drug delivery systems (TDDS) in cancer. In this thesis, the MacroDel (Macromolecular Delivery), a synthetic polysulfated Dendron made of glycerol monomers, is evaluated regarding its ability to act as a TDDS for enzymes. Several enzymes have high cytotoxic potential. However, the inability to transport them to their cytoplasmatic target has been the major reason why enzymes have rarely been used in chemotherapies. By using the example of RNase, DNase and Asparaginase, this thesis analyses the potential of MacroDels as targeted drug delivery systems for enzymes in cancer treatment. Methods: The conjugation of the enzymes to the MacroDel was controlled through native gelelectrophoresis and the enzyme activity after conjugation through photometry. The MacroDel and the MacroDel-enzyme conjugates were conjugated to ICC-dyes. The in vitro uptake and distribution were then analysed on all cancer cell lines using flow cytometry and fluorescence microscopy. The in vivo analysis was performed on Nude-Fox1nu mices transplanted with the human coloncarcinoma HT29 and a gastropancreatic tumor. Cytotoxicity of the MacroDel and its enzyme-conjugates were examined in vitro using MTT-assays. The uptake of the MacroDel and its conjugates were analysed by inhibiting OATP1B1 with Rifamycin. Results: It could be shown that the conjugation of enzymes to the MacroDel is possible without losing enzymatic activity. Furthermore, it could be demonstrated that all cancer cell lines take up the MacroDel and the MacroDel-enzyme conjugates in vitro and accumulate in vivo in cancer tissues. Their uptake is downregulated by the Inhibition of OATP-Transporters. Additionally the MacroDel and the MacroDel-enzyme conjugates show a cytotoxic effect on several cancer cell lines in vitro. Conclusion: For the first time, it could be shown that MacroDels are able to target enzymes to cancer tissues. Furthermore, it could be demonstrated that MacroDels and the MacroDel-enzyme conjugates are directly uptaken into the cytoplasm of cancer cells by transporters. Consequently, MacroDels represent a promising TDDS for enzymes in cancer that should be further investigated. Also the MacroDel would enable the targeting of a multitude of new cytoplasmatic structures that were inaccessible before