Molekulare Marker der Mechanorezeptoren und potenzielle Moleküle zur Steuerung der Mechanotransduktion

In somatosensory perception the neurons of the dorsal root ganglia (DRG) are the first responders to the different types of stimuli applied on the skin, and a specific type of stimulus also activates a specific subtype of sensory afferents. Genetic labelling of DRG cell subtypes allows their identification in vivo and in vitro providing a unique opportunity to study the physiology of these cells and could give insights into what makes them modality specific. The first part of this study aimed to use the promoter of the T-type calcium channel subunit 3.2 (Cav3.2) as a molecular marker for the mechanical ultra sensitive subpopulation of DRG cells, the putative D-hair receptors. Using a knock-in approach two mouse strains were produced. The first strain expresses the GFP protein under the promoter of the Cav3.2 ion channel (Cav3.2GFP). Characterization of the Cav3.2GFP knock-in mouse using immunofluorescence analysis showed that the promoter of the Cav3.2 ion channel is strongly activated in the hippocampus in the brain of adult mice. In addition, the activity of the Cav3.2 ion channel promoter in the DRG was also determined in development. Analysis of GFP expression using immunofluorescence, Western blot and qPCR, showed that GFP protein can be detected at stage E9.5 in some cells of the neuronal crest. At stage E13.5 few GFP+ cells are observed in the DRG, and at stage E18.5 GFP is expressed in 7% of the cells of the DRG. Characterization of sensory afferent subtypes at E18.5 using immunofluorescence showed that GFP+ cells co-stained with TrkB and TrkC and only few GFP+ cells were TrkA positive. The second strain expresses the CRE recombinase under the promoter of the Cav3.2 ion channel (Cav3.2Cre). Breeding of the Cav3.2Cre mouse with the reporter line Tau(mGFP) permited the analysis of innervation of the sensory end organs in the skin. GFP+ afferents in Cav3.2Cre; Tau(mGFP) animals innervated hair follicles and Meissner corpuscles, but not Merkel cells. The GFP signal in Cav3.2Cre; Tau(mGFP) animals was sufficient for visualization of GFP+ DRG cells in vitro so that electrophysiological characterization of GFP+ DRG cells in cell culture was possible. Whole-cell current clamp recordings showed that about 50% of GFP+ DRG cells have action potential with characteristics of mechanoreceptors and that the other 50% of GFP+ DRG cells showed action potential with characteristics of nociceptors. Although the Cav3.2 promoter did not show high expression specificity only for D-hair receptors as expected, the strains generated are still very useful tools to study the physiology of cells expressing this subtype of T-type calcium channel and its role in those cells. In contrast to the large body of information regarding the physiological and anatomical properties of primary afferents and despite the extensive efforts to identify mechanotransduction genes in mammals, the molecular components of the transduction complex in DRG are still elusive. In mice only the stomatin- like protein-3 (SLP-3) has been shown to be essential for touch sensation. In the second part of this work I screened for a 100 nm long tether protein shown previously in my laboratory to be involved in mechanotransduction by connecting the transduction channel to the extracellular matrix. The tether protein is expressed in DRG but not in SCG, binds to laminin and is cleaved by furing proteinase. A pre-selection of candidate proteins to tether protein were made using a Phython script to search for proteins with a furin cleavage site in the mouse genome. Subsequently the expression of these proteins was determined in DRG vs. SCG using qPCR, and from this analysis only six proteins were selected as potential candidates. Using microcontact printing, it was shown that six tether protein candidates localized to neurites growing on laminin but not on neurites growing on laminin-332. After immunogold labeling and transmission electron microscopy (TEM) of the six protein candidates only two proteins remain promising candidates for the tether protein.Primär sensorische Neurone, deren Zellkörper in den dorsalen Wurzelganglien liegen, sind die ersten Neurone, die Informationen ueber verschiedene Stimulationen der Haut weiterleiten. Dabei führt ein spezifischer Stimulus zur Aktivierung eines spezifischen Subtyps dieser sensorischen Afferenzen. Mit Hilfe genetischer Marker können die verschiedenen Nervenzelltypen in vitro und in vivo in den dorsalen Wurzelganglien identifiziert werden. Dies ermoeglicht die Untersuchung der Physiologie und der Spezifizität der Modalität dieser Zellen. Im ersten Teil dieser Studie wurde der Promotor des T-Typ Kalzium- Kanals der Untereinheit 3.2 (Cav3.2) als molekularer Marker für putative D-Haarrezeptoren, die sensitivste Subpopulation mechanischer Zellen der dorsalen Wurzelganglien, verwendet. Zwei knock-in Mausstämme wurden in dieser Studie generiert. Der erste Mausstamm exprimiert grün fluoreszierendes Protein (GFP) unter Kontrolle des Promotors des Cav3.2 Ionenkanals (Cav3.2GFP). Durch immunohistochemische Charakterisierung des Cav3.2GFP knock-in Mausstamms konnte gezeigt werden, dass im Hippocampus adulter Mäuse der Promotor des Cav3.2 Ionenkanals sehr stark aktiviert ist. Zusätzlich wurde die Aktivität des Promotors für den Cav3.2 Ionenkanal im Laufe der Entwicklung bestimmt. Durch die Analyse der GFP-Expression mittels Immunofluoreszenz, Western Blot und qPCR konnte gezeigt werden, dass GFP während des Embryonalstadiums E9,5 in einigen Zellen der Neuralleiste exprimiert wird. Im Embryonalstadium E13,5 konnten nur wenige GFP+ Zellen in den dorsalen Wurzelganglien lokalisiert werden, während im Embryonalstadium E18,5 GFP in 7 % der Zellen der dorsalen Wurzelganglien detektiert werden konnte. Die immunzytochemische Charakterisierung verschiedener Subtypen sensorischer Afferenzen hat gezeigt, dass die GFP+ Zellen positiv für TrkB (Mechanorezeptoren) und TrkC (Propriozeptoren) waren und nur wenige positiv für TrkA (Nozizeptoren). Im zweiten Mausstamm wird die Cre-Rekombinase unter Kontrolle des Promotors des Cav3.2 Ionenkanals (Cav3.2Cre) exprimiert. Durch die Kreuzung der Cav3.2Cre Maus mit der Reportermaus Tau(mGFP) konnte die Innervierung der putativen D-Haarrezeptoren in den Sinnesendorganen der Haut untersucht werden. Eine Innervierung mit GFP+ Afferenzen konnte in Haarfollikeln und Meissner- Körperchen, jedoch nicht in Merkel-Zellen nachgewiesen werden. Des Weiteren wurden die Zellen der dorsalen Wurzelganglien der Cav3.2Cre; Tau(mGFP) Maus primaer kultiviert und die GFP+ Zellen elektrophysiologisch charakterisiert. In Patch-Clamp- Messungen, durchgefuehrt in der Ganz-Zell-Konfiguration, konnte gezeigt werden, dass 50 % der GFP+ Zellen Aktionspotentiale charakteristisch für Mechanorezeptoren und 50 % solche charakteristisch für Nozizeptoren erzeugen. Obwohl der Cav3.2 Promotor wider Erwarten nicht spezifisch in D-Haarrezeptoren exprimiert wird, sind die generierten Mausstämme für Untersuchungen der Physiologie dieses T-Typ Kalziumkanals nuetzlich. Heute existiert ein breites Wissen über die physiologischen und anatomischen Eigenschaften der primären Afferenzen und in der experimentellen Forschung wurden große Anstrengungen zur Identifizierung der an der Mechanotransduktion beteiligten Gene in Säugern unternommen. Jedoch konnten die molekularen Komponenten des Transduktionskomplexes der dorsalen Wurzelganglien bislang nicht identifiziert werden. In der Maus konnte lediglich Stomatin-ähnliches Protein 3 (SLP-3) als für den Tastsinn essentielles Protein gefunden werden. Aus diesem Grund wurde im zweiten Teil dieser Arbeit nach der Identitaet eines 100 nm langen Halteproteins, dessen Existenz zuvor in meinem Labor bewiesen wurde. Dieses Protein ist funktionell an der Mechanotransduktion beteiligt, indem es moeglicherweise den Transduktionskanal mit der extrazellulären Matrix verbindet. Das Halteprotein wird in dorsalen Wurzelganglien, jedoch nicht in den superioren zervikalen Ganglien exprimiert, bindet an Laminin und wird durch Furin-Proteinasen gespaltet. Eine Vorauswahl möglicher in Frage kommender Kandidaten wurde durch die Verwendung eines Phython-Skripts vorgenommen, um nach Proteinen mit einer Furin-Spaltstelle im Mäusegenom zu suchen. Anschließend wurde die Expression dieser Proteine mit qPCR in dorsalen Wurzelganglien bestimmt und mit superioren zervikalen Ganglien verglichen. Mittels dieser Analyse wurden sechs potentielle Kandidaten selektiert. Diese wurden durch Mikro-Kontakt-Printing in Neuriten von auf kommerziellem Laminin wachsenden doralen Wurzelganglienzellen lokalisiert. In Neuriten von auf Laminin-332 wachsenden Zellen konnten diese Proteine nicht lokalisiert werden. Durch Immunogold- Färbung und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) konnte ein Teil dieser Protein-Kandidaten subzellulär in Zellen der dorsalen Wurzelganglien lokalisiert werden. Aufgrund dieser Ergebnisse könnten zwei der untersuchten Proteine mögliche Kandidaten für das Halteprotein sein