Funktionelle Charakterisierung von GYF-Domänen Proteinen

TABLE OF FIGURES I SUMMARY I ZUSAMMENFASSUNG III 1 INTRODUCTION 1 1.1 Molecular Interactions of GYF domains 2 1.2 The GYF-domain Family 3 1.3 The Role of GYF-domains in the Immune System 5 1.4 The Role of CD2BP2-GYF in Spliceosome Assembly 8 1.5 The GYF-domain protein GIGYF2 10 1.5.1 Smy2-type GYF-domain containing proteins exert their function in the cytoplasm 11 1.6 Targeted Mouse Mutations 14 1.6.1 The history of targeted gene transfer 14 1.6.2 Conditional gene targeting 16 1.6.3 The knockout workflow 17 1.7 The Aim of this Study 20 2 MATERIAL AND METHODS 21 2.1 Material 21 2.1.1 DNA constructs 21 2.1.2 Commercially available DNA constructs 21 2.1.3 DNA-Primer 22 2.1.4 DNA and proteins Markers 25 2.1.5 Buffers and Media 25 2.1.6 Bacteriophage P1 artificial chromosome library 29 2.1.7 Antibodies 30 2.1.8 Bacteria 31 2.1.9 Consumables 32 2.1.10 Instruments 33 2.1.11 Kits 34 2.1.12 Software 34 2.2 DNA and RNA methods 36 2.2.1 DNA restriction digest 36 2.2.2 Polymerase Chain Reaction 36 2.2.3 DNA- Ligation 36 2.2.4 Annealing of DNA- Oligomers 37 2.2.5 Chemical DNA Transfection 37 2.2.6 DNA Transfection via Electroporation 37 2.2.7 siRNA knockdown via Electroporation 37 2.2.8 Colony PCR 38 2.2.9 Colony Hybridization 38 2.2.10 DNA purification via Phenol/ Chloroform extraction 38 2.2.11 Precipitation of small amounts of DNA with Isopropanol 38 2.2.12 Precipitation of large amounts of DNA with Isopropanol 38 2.2.13 DNA Sequencing 39 2.2.14 Generation of probes for Southern blots 39 2.2.15 Radioactive Labeling with Rediprime 39 2.2.16 Radioactive double labeling with random hexameres 39 2.2.17 DNA purification 40 2.2.18 Southern blotting 40 2.2.19 Production of salmon sperm DNA for Southern blotting 41 2.2.20 RNA extraction from mouse organs 41 2.2.21 Reverse Transcription 41 2.2.22 Real-Time PCR with TaqMan® Probes 42 2.3 Protein Analysis 42 2.3.1 Protein Expression in Escherichia Coli 42 2.3.2 Protein Expression of his- CD2BP2 in SF9 Insect cells 42 2.3.3 Bradford Assay 43 2.3.4 Protein extraction from mouse organs 43 2.3.5 Pull-down 43 2.3.6 Immunoprecipitation with agarose beads 43 2.3.7 Cell fractionation 44 2.3.8 SDS-PAGE 44 2.3.9 Coomassie® Staining 44 2.3.10 Western blot 44 2.3.11 Mass spectrometry 44 2.3.12 SILAC Pull-down MS 45 2.3.13 Staining of immune cells for cell sorting 46 2.3.14 Extracellular and intracellular staining of immune cells 47 2.3.15 Antibody competition assay 47 2.4 Cell lines 48 2.4.1 Maintaining adherent cell lines 48 2.4.2 Maintaining suspension cell lines 48 2.4.3 Coating of Cover Slips 48 2.4.4 Transfection of adherent cells 48 2.4.5 Confocal laser scanning microscopy 49 2.4.6 Generation of Murine Adult Fibroblasts (MAF) 49 2.4.7 Protein purification via ion exchange chromatography 49 2.5 Generation of polyclonal antibodies in rabbit 49 2.6 Excision test of loxP sites in EL350 cells 49 2.7 Stem cell culture 50 2.7.1 Mouse embryonic fibroblasts (Feeder Cells) 50 2.7.2 Electroporation of murine Stem Cells 50 2.7.3 Positive and negative stem cell selection 51 2.7.4 Picking of stem cell colonies 51 2.7.5 Splitting of ES-cell for genotyping and back-up plates 51 2.7.6 Freezing of ES-cell back-up plates 51 2.7.7 Expansion of genotyping plates and DNA extraction 51 2.7.8 Mouse genotyping 52 2.7.9 Mouse housing and handling 54 3 RESULTS 55 3.1 Functional characterization of the protein GIGYF2 55 3.1.1 Generation and characterization of anti-GIGYF2-GYF 55 3.1.2 Localization and expression studies of GIGYF2 56 3.1.3 Screening for new interaction partners of GIGYF2 59 3.1.4 Immunofluorescence co-localization studies 60 3.2 Functional characterization of CD2BP2 in mice 67 3.2.1 Generation of a polyclonal antibody against CD2BP2 67 3.2.2 CD2BP2 RNA and protein levels in mice 71 3.2.3 Fluorescence Activated Cell Sorting of immune cells 73 3.2.4 Intracellular staining of immune cells 74 3.3 Conditional Gene Targeting of CD2BP2 88 3.3.1 The gene of CD2BP2 88 3.3.2 The targeting scheme 89 3.3.3 Cloning of the targeting vector 90 3.3.4 Screening for positive ES cell clones 96 3.3.5 Laser-assisted eight cell-stage injection of clones and germline breeding 99 3.3.6 Mouse Breeding 100 4 DISCUSSION 108 4.1 Potential Functions of GIGYF2 108 4.1.1 GIGYF2 localization in cell lines and mouse organs 108 4.1.2 Potential interaction partners of GIGYF2 109 4.2 Characterization of CD2BP2 112 4.2.1 Generation of anti-CD2BP2 antibody 113 4.2.2 Different expression of CD2BP2 on mRNA versus protein level 113 4.2.3 Widespread expression of CD2BP2 in murine immune cells 114 4.2.4 CD2BP2 mouse model 117 5 OUTLOOK 123 5.1 Future Studies of GIGYF2 123 5.2 Future Studies to analyze the immune function of CD2BP2 123 5.3 Future studies to analyze embryonic lethality of CD2BP2 124 REFERENCES 125 SUPPLEMENT 137 Abbreviations 137 Sequence of pPNT4-CD2BP2 141 ACKNOWLEDGEMENT 144 PUBLICATIONS/ POSTERS/ AWARDS 146 Publications 146 Posters presented during this study 146 Talks given during this study 147 Awards 147 CURRICULUM VITAEGYF-domains (standing for a conserved glycine, tyrosine, phenylalanine motif) are small adapter domains that interact with proline-rich sequences (PRS) of other proteins. Two subfamilies have been described so far that both differ in the binding behavior of the respective GYF-domain. The CD2BP2-type subfamily is named after the first GYF protein discovered, the CD2 binding protein 2. This protein was found as binding partner of the T cell adhesion molecule CD2. Independent work showed an involvement of CD2BP2 in nuclear mRNA splicing. The Smy2-type subfamily is named after the yeast suppressor of myosin 2-66. The human and mouse ortholog of Smy2 is called Grb-10 interacting GYF protein 2 (GIGYF2). Here, very little was known about the function at the beginning of this study. The aim of this study was to characterize the two proteins GIGYF2 and CD2BP2 in different cell lines and mouse organs for a better understanding of their functional implications within the cell. Also, a conditional CD2BP2 knockout (KO) mouse was generated to primarily address the question of whether or not mice can survive without CD2BP2. Expression analyses by a newly generated antibody against the GIGYF2 GYF-domain were performed to show the specificity of the antibody. The localization of GIGYF2 was addressed with nuclear and cytoplasmic extracts of human HeLa and rat pc12 cells, showing a cytoplasmic localization of the protein. GIGYF2 showed a ubiquitous protein expression in different mouse organs of C57BL/6 (BL6) mice with the least amounts in the kidney. Novel potential interaction partners suggested by pull- down in combination with SILAC-MS analyses were confirmed by immunofluorescence co-localization studies. Analyses in HeLa cells and the neuronal cell lines SH-SY5Y and Neuro2a showed the localization of GIGYF2 to the ER and Golgi in living cells and its co-localization with the COPII vesicle component Sec31 in fixed cells. Also, GIGYF2 was stress-dependently recruited into cytoplasmic stress granules (SGs), where it co-localized with the SG marker TIA-1. A stress-dependent co-localization with TIA-1 could also be observed in neurites of SH-SY5Y cells. Expression analyses of CD2BP2 in mouse organs showed a ubiquitous expression at the mRNA level whereas it was mainly expressed in hematopoietic organs at the protein level. A more detailed analysis in immune cells revealed the presence of CD2BP2 in mature B and T cells, dendritic cells and macrophages. Studies in developing T cells showed the expression of CD2BP2 at double negative stage 1 (DN1) and subsequent stages. For the generation of a conditional CD2BP2 KO mouse, a targeting vector was cloned and electroporated into 129 and BL6 strain derived murine stem cells (ES cells). Positive clones were injected into morulae and implanted into foster mothers. Only 129-derived ES cell clones gave rise to high chimeric offspring. Germline transmitted founder mice were bred with PGK- Cre deleter mice for the induction of the KO. Breedings of CD2BP2+/- mice resulted in no homozygous KO. Analysis of timed matings showed embryonic lethality of CD2BP2 null mice before embryonic day 10.5. From this study, we strongly favor the hypothesis that GIGYF2 is involved in the assembly or regulation of ribonuculear protein complexes. Future studies should focus on its involvement in the transport of mRNA from the cell soma to neurites within neuronal cells. Mice cannot survive without CD2BP2. The predominant hematopoietic expression in adult mice speaks for a major function in the immune system. Why this gene, which is expressed in all organs at RNA level, is down regulated at the protein level needs to be addressed in future studies. Also, the reason for the lethality during embryonic development will help to understand the function of this GYF-domain containing protein in more detail.GYF-Domänen, die nach einem konservierten Glycin, Tyrosin, Phenylalanin Motiv benannt sind, sind kleine Adapterdomänen, die mit prolinreichen Sequenzen anderer Proteinen interagieren. Bisher wurden zwei Unterklassen beschrieben, die sich im Bindungsverhalten der GYF-Domäne unterscheiden. Die CD2BP2-Typ Unterfamilie wurde nach dem CD2 bindenden Protein 2 (CD2BP2) benannt, in dem die erste GYF-Domäne identifiziert wurde. CD2BP2 erkennt die zytoplasmatischen prolinreichen Sequenzen des T Zell Adhesionsmoleküls CD2. Weitere Studien zeigten eine Beteiligung von CD2BP2 an splißosomalen Prozessen im Zellkern. Die Smy2-Typ Unterfamilie wurde nach dem Hefeprotein „Suppressor of myosin 2-66“ (Smy2) benannt. Ein zu Smy2 humanes und murines Ortholog ist das „Grb-10 interacting GYF protein 2“ (GIGYF2). Über dieses Protein war zu Beginn dieser Arbeit sehr wenig bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit sollten die beiden Proteine CD2BP2 und GIGYF2 in verschiedenen Zelllinien und Organen der Maus im Bezug auf ihre zelluläre Funktion charakterisiert werden. Weiterhin wurde eine konditionelle CD2BP2 Knockout (KO) Maus generiert, um die primäre Frage zu beantworten, ob Mäuse ohne CD2BP2 lebensfähig sind. Die Spezifität eines neu hergestellten Antikörpers gegen die GYF-Domäne von GIGYF2 wurde mittels Expressionsanalysen bewiesen. Für die Untersuchung der zellulären Lokalisation von GIGYF2 wurden nukleare und zytoplasmatische Zellextrakte aus humanen HeLa Zellen und aus Ratten pc12 Zellen eingesetzt. Beide Zelltypen zeigten eine hauptsächlich zyoplasmatische Expression des Proteins. Untersuchungen an Zelllysaten verschiedener C57BL/6 (BL6) Mausorgane wiesen auf eine ubiquitäre Expression von GIGYF2 in Mausorganen hin. Am geringsten wurde das Protein in der Niere exprimiert. Vorangegangene Pull-down-Experimente in Kombination mit der massenspektrometrischen Analyse der Bindungspartner (SILAC-MS) hatten neue potentielle Interaktionspartner von GIGYF2 hervorgebracht, die mittels Kolokalisationsstudien genauer untersucht wurden. Studien in lebenden HeLa Zellen, den neuronalen Zelllinien SH-SY5Y und Neuro2a zeigten, dass GIGYF2 innerhalb der Zelle im ER und dem Golgi Apparat lokalisiert ist. In fixierten Zellen kolokalisierte GIGYF2 mit dem COPII Vesikel Protein Sec31 und wurde stressinduziert in zytoplasmatische „stress granules“ (SG) rekrutiert. Diese stressinduzierte Kolokalisation mit dem SG Markerprotein TIA-1 wurde auch in Neuriten von SH-SY5Y Zellen beobachtet. CD2BP2 Expressionsanalysen in verschiedenen Mausorganen zeigten eine ubiquitäre Expression auf mRNA Ebene wohingegen CD2BP2 auf Proteinebene hauptsächlich in hämatopoetischen Organen gefunden wurde. Eine detaillierte Expressionsanalyse in Immunzellen detektierte CD2BP2 in reifen B und T Zellen, Dendritischen Zellen und Makrophagen. In unreifen T Zellen wurde CD2BP2 schon im frühesten Entwicklungsstadium, der doppelt negativen Phase 1, gefunden. Zur Herstellung einer konditionellen CD2BP2 KO Maus wurde ein Zielvektor kloniert, der in murine Stammzellen der Stämme 129 und BL6 elektroporiert wurde. Daraus resultierende positive Klone wurden in Morulae injiziert und in Leihmütter implantiert. Nur die Stammzellklone des 129er Stamms führten zu hochchimären Mäusen. Mäuse, die den Zielvektor durch Keimbahntransmission in ihrem Genom integriert hatten, wurden für die Induktion des KO mit PGK-Cre Mäusen verpaart. Die Verpaarung von CD2BP2+/- Mäusen erbrachte keine homozygoten CD2BP2 KO Mäuse. Bei zeitlich kontrollierten Verpaarungen starben CD2BP2 KO Mäuse vor dem Embryonaltag 10,5. Die Ergebnissen dieser Studie legen nahe, dass GIGYF2 in die Assemblierung oder Regulation von ribonuklären Proteinkomplexen involviert ist. In zukünftigen Studien sollte weiterhin die Funktion von GIGYF2 bei dem neuronalen Transport von mRNA vom Zellsoma in Neuriten untersucht werden. Für Mäuse ist CD2BP2 offensichtlich ein essentielles Gen. Die hauptsächliche Expression von CD2BP2 in hämatopoetischen Organen adulter Mäuse spricht für eine späte Hauptfunktion im Immunsystem. Der Grund für die unterschiedliche Expression von CD2BP2 auf mRNA und Protein Ebene muß in zukünftigen Studien untersucht werden. Der Grund für die embryonale Letalität des GYF-Domänen Proteins CD2BP2 sollte helfen, wichtige, an dieses Protein gekoppelte Prozesse innerhalb des Organismus genauer zu verstehen