Molekularer Mechanismus und Funktion der endozytischen Sortierung von Synaptotagmin 1 in zentralen Synapsen

I Table of Content I II Summary V III Zusammenfassung VII 1\. Introduction 9 1.1. Neurotransmission at chemical synapses 9 1.2. SV recycling 9 1.3. The synaptic vesicle (SV) 12 1.4. The SV protein synaptotagmin 1 13 1.5. Sorting of SV proteins 15 1.5.1. SV protein sorting by AP-2 17 1.5.2. Stonin2 – a specific sorting adaptor for Syt1 18 1.5.3. Synaptic vesicle protein 2 (SV2) in SV protein complex formation 20 1.6. Coupling of exocytosis and endocytosis 22 1.7. PI(4,5)P2 at the presynapse 24 1.7.1. PI(4,5)P2 during SV exocytosis 26 1.7.2. The role of PI(4,5)P2 during SV endocytosis 28 1.7.3. PIPK1γ as the major PI(4,5)P2 synthesizing kinase in the brain 29 2\. Aims of this study 32 3\. Material and Methods 33 3.1. Materials 33 3.1.1. Chemicals 33 3.1.2. Buffers, Media and Solutions 33 3.1.3. Enzymes and kits 40 3.1.4. Molecular weight standards 41 3.1.5. Small interfering RNA and synthetic DNA oligonucleotides 41 3.1.6. Plasmid vectors 43 3.1.7. Antibodies 44 3.1.8. Bacterial strains 46 3.1.9. Eukaryotic cell lines 46 3.1.10. Mouse strains 47 3.1.11. Software and internet resources 48 3.2. Molecular biology methods 49 3.2.1. Cloning strategies 49 3.2.2. Polymerase chain reaction and site directed mutagenesis 49 3.2.3. Analytical agarose gel electrophoresis and DNA purification 51 3.2.4. DNA restriction digests 51 3.2.5. Ligation of DNA fragments into linearized vectors 52 3.2.6. Transformation of chemically competent E. coli 52 3.2.7. Purification of plasmid DNA from E. coli cultures 52 3.2.8. Measurement of DNA concentrations 53 3.2.9. Sequencing of DNA 53 3.2.10. Cryostocks of bacterial clones 53 3.2.11. Isolation of genomic DNA from mouse tissue 54 3.2.12. Genotyping of mouse strains 54 3.3. Cell biological methods 56 3.3.1. Cell culture of HEK 293T cells 56 3.3.2. Transfection of HEK 293T cells with jetPRIME 57 3.3.3. Transfection of HEK 293T cells with Lipofectamin 2000 57 3.3.4. Preparation of primary hippocampal neurons 58 3.3.5. Calcium phosphate transfection of primary hippocampal neurons 59 3.3.6. Silencing of primary hippocampal neuron cultures 59 3.3.7. Stimulation of primary hippocampal neuron cultures 60 3.3.8. Immunocytochemistry 60 3.4. Fluorescent microscopy and quantitative image analysis 62 3.4.1. Epifluorescent microscopy 62 3.4.2. Confocal microscopy 63 3.4.3. Stimulated emission depletion (STED) microscopy and analysis 63 3.4.4. pHluorin live-cell imaging 65 3.4.5. Calcium live-cell imaging 69 3.5. Biochemical methods 70 3.5.1. Preparation of HEK 293T cell lysates 70 3.5.2. Preparation of mouse brain extracts 70 3.5.3. Protein quantification using Bradford assay 70 3.5.4. Expression of recombinant proteins in E.coli 71 3.5.5. Affinity-purification of GST- and His6-fusion proteins 71 3.5.6. GST- pulldown from rat brain extract 72 3.5.7. Co-Immunoprecipitation of synaptosomal extracts 72 3.5.8. SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS- PAGE) 73 3.5.9. Immunoblotting 74 3.5.10. Coomassie staining of SDS- polyacrylamide gels 75 3.6. Histological Methods 75 3.6.1. Perfusion of mice 75 3.6.2. Cryosectioning of mouse brains 76 3.6.3. Nissl staining 76 3.6.4. Immunohistochemistry 76 3.7. Electron microscopy 77 3.8. Electrophysiology 78 3.8.1. Input-output recordings, short term plasticity and high frequency stimulation train recordings 78 3.8.2. mEPSC recordings 79 3.8.3. Membrane capacitance measurements at the calyx of Held 79 3.9. Statistical analysis 80 4\. Results 81 4.1. Sorting of synaptotagmin 1 during SV recycling 81 4.1.1. Generation and characterisation of SV2A/B x Stn2 triple knockout mice 81 4.1.2. Combined deletion of SV2A/B and Stn2 aggravates Syt1 loss in vivo 85 4.1.3. Knockdown of SV2A in hippocampal neuron culture causes partial Syt1 loss 88 4.1.4. Impaired Syt1 sorting in the absence of Stn2 and SV2A show additive defects 89 4.1.5. SV2A regulates Syt1 sorting to SVs during neuronal activity 92 4.1.6. Combined deficiency of Stn2 and SV2A/B aggravates impaired evoked release 95 4.1.7. Exacerbated reduction of release probability by additional depletion of Stn2 in SV2A/B DKO 97 4.2. The molecular function of Syt1 sorting at the synapse 100 4.2.1. Accelerated endocytic retrieval in the absence of Syt1 sorting adaptors 100 4.2.2. Calcium influx during stimulation is not affected in Stn2 depleted neurons 105 4.2.3. PI(4,5)P2 levels are specifically increased in Stn2 deficient neurons 106 4.2.4. Syt1 redistribution correlates with elevated PI(4,5)P2 levels 108 4.2.5. Syt1 interacts with PIPK1γ 110 4.2.6. Overexpression of Syt1 and PIPK1γ in HEK cells mimic elevated PI(4,5)P2 levels 112 4.2.7. Facilitated recruitment of PIPK1γ to the plasma membrane in Stn2 deficient neurons 114 5\. Discussion 120 5.1. Integrating cargo specific SV protein sorting in SV reformation 120 5.1.1. Overlapping activities of SV2 and Stn2 in Syt1 sorting 121 5.1.2. Spatio-temporal regulation of Syt1 sorting 123 5.2. Functional implications of Syt1 sorting in central synapses 126 5.2.1. Regulation of Syt1 levels and turnover by SV2/Stn2 126 5.2.2. Functional consequences of Syt1 redistribution and loss for neurotransmission 127 5.2.3. Speed of SV retrieval independent of Syt1 sorting 129 5.3. Coupling of SV exo- and endocytosis by SV proteins 130 5.3.1. Surface-localized Syt1 as an exo-endocytic coupling factor 131 5.3.2. PI(4,5)P2 as an effector molecule of surface-stranded Syt1 132 5.3.3. Syt1 interacts and recruits PIPK1γ 136 5.3.4. Other potential effectors regulated by PI(4,5)P2 in SV exo- and endocytosis 138 6\. Outlook 141 7\. Bibliography 143 8\. Appendix 165 8.1. Appendix A: Abbreviations 165 8.2. Appendix B: Supplementary Figures 168 8.3. Appendix C: List of Tables and Figures 173 8.3.1. List of Tables 173 8.3.2. List of Figures 173 8.4. Appendix D: Publications 176 8.5. Appendix E: Curriculum Vita 177Communication in the central nervous system relies on fast and precise neurotransmission at synapses. The arrival of an action potential at the presynapse triggers the calcium regulated exocytic fusion of synaptic vesicles (SVs). Exocytosis and neurotransmitter release are followed by local SV membrane retrieval and reformation of functional SVs with the correct size and protein composition that can replenish the SV pool and thereby maintain neurotransmission. In spite of decades of research many aspects of SV recycling remain unclear. In particular, the precise sorting of surface- stranded SV proteins during SV endocytosis as well as the coupling of SV exo- and endocytosis are still unknown. To address these open questions, we investigated whether the endocytic sorting of synaptotagmin 1 (Syt1), the calcium sensor for SV exocytosis, is ensured by two mechanisms in mammals: by a dedicated endocytic adaptor as well as by complex formation with another SV protein. Further, we examined the functional consequences of Syt1 sorting in mammalian synapses. I could show that endocytic sorting and maintenance of Syt1 at mammalian synapses is mediated by overlapping activities of stonin 2 (Stn2) and the SV glycoprotein SV2A/B. Deletion or knockdown of either SV2A/B or Stn2 resulted in partial Syt1 loss and missorting of Syt1 to the neuronal surface in brain slices and hippocampal neurons in culture. Combined deletion of both SV2A/B and Stn2 dramatically aggravated this phenotype. The repartitioning of Syt1 to the neuronal plasma membrane is dependent on neuronal activity and led to a partial loss of Syt1 from recycling SVs. Consequently, the defective Syt1 sorting to SVs in the absence of SV2A/B and Stn2 impaired basal neurotransmission. These results suggest that SV2A/B and Stn2 share an overlapping function in mediating endocytic sorting of Syt1 to SVs at mammalian synapses and favor a model according to which SV protein sorting is guarded by both cargo-specific endocytic adaptors as well as complex formation of SV proteins. Interestingly, we found that deletion of the Syt1 sorting adaptors Stn2 and SV2A/B accelerated endocytic retrieval and facilitated SV exocytosis in response to repetitive electrical stimulation in hippocampal neurons. The surface-stranding of Syt1 in the absence of Stn2 and the augmented SV exo- and endocytosis correlated with elevated presynaptic levels of phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate [PI(4,5)P2], a membrane phospholipid essential for SV exocytic fusion and endocytic retrieval. In contrast, the levels of another plasma membrane residing phosphoinositide, PI(4)P, remained unchanged. Increased presynaptic PI(4,5)P2 levels likely are caused by the direct association of Syt1 with phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase type I (PIPK1γ), the major PI(4,5)P2-synthesizing enzyme at synapses. Indeed, superresolution nanoscopy revealed a selective relocalization of PIPK1γ towards the plasma membrane in Stn2 depleted and thus Syt1 surface-enriched neurons. Taken together, my data suggest that Syt1 at the axonal surface triggers the recruitment of PIPK1γ to facilitate local PI(4,5)P2 synthesis at or near release sites and couples thereby PI(4,5)P2-dependent SV exo- and endocytosis.Die Kommunikation im zentralen Nervensystem basiert auf einer schnellen und präzisen Erregungsübertragung an Synapsen. Sobald ein Aktionspotential die Präsynapse erreicht, löst es die Kalzium-regulierte Verschmelzung synaptischer Vesikel (SV) an der aktiven Zone aus. Die Exozytose und Freisetzung von Neurotransmittern folgt die Rückgewinnung der fusionierten Membran und Bildung neuer funktionaler SV, welche wieder die richtige Größe und vor allem die korrekte Proteinzusammensetzung aufweisen müssen, um die fusionierten SV zu ersetzen. Dies ist notwendig, um lang anhaltende Neurotransmission sicher zu stellen. Trotz jahrelanger intensiver Forschung sind viele Aspekte dieses Recyclings der SV nicht geklärt. Besonders, die präzise Sortierung während der Endozytose von an der Oberfläche zurückgebliebenen SV Proteine sowie die Kopplung von Exo- und Endozytose sind noch immer unbekannt. Um diese offenen Fragen zu beantworten, haben wir untersucht, ob die Sortierung von Synaptotagmin 1 (Syt1), dem Kalzium-Sensor für die SV Fusion, in Säugetieren durch zwei Mechanismen sichergestellt wird: durch einen spezifischen, endozytotischen Adaptor sowohl als auch durch Komplexbildung mit einem weiteren SV Protein. Darüber hinaus haben wir die funktionalen Konsequenzen von der Syt1-Sortierung in Säugetiersynapsen erforscht. In dieser Arbeit konnte ich zeigen, dass die Sortierung während der Endozytose sowie die Erhaltung von Syt1 durch überlappende Funktionen von dem spezifischen Adaptor stonin 2 (Stn2) und dem SV Protein SV2A/B in der Säugetiersynapse gewährleistet werden. Das Fehlen von SV2A/B oder Stn2 führte zu einem partiellen Verlust von Syt1, einhergehend mit der Akkumulation von Syt1 an der Zelloberfläche von Neuronen in Gehirnschnitten und in hippocampalen neuronalen Kulturen. Die Abwesenheit beider Proteine, Stn2 und SV2A/B, verstärkte diesen Phänotyp dramatisch. Zusätzlich konnte ich bestätigen, dass die Umverteilung von Syt1 zur Zelloberfäche von neuronaler Aktivität abhängig und für den Verlust von vesikulärem Syt1 verantwortlich ist. Die mangelnde Präzision der Syt1-Sortierung führte folglich zu einer stark eingeschränkten Neurotransmission. Diese Ergebnisse weisen daher auf überlappende Aktivitäten von Stn2 und SV2A/B in der Säugetiersynapse hin, um Syt1 in SV zu sortieren. Weiterhin lassen die Daten darauf schließen, dass die SV Protein Sortierung mit Hilfe zweier Mechanismen sichergestellt wird: einerseits durch spezifische Adaptoren, andererseits durch die Assoziation von SV Proteinen miteinander. Überraschenderweise beschleunigt die Abwesenheit der Syt1-Sortierungsproteine SV2A/B und Stn2 sogar die Aufnahme der SV Proteine und verstärkt zudem die SV Exozytose, wenn hippocampale Neurone repetitiv elektrisch stimuliert werden. Die Akkumulation von Syt1 an der neuronalen Zelloberfläche korreliert nicht nur mit der gesteigerten SV Exo- und Endozytose, sondern auch mit erhöhten präsynaptischen Konzentrationen von Phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphat [PI(4,5)P2]. PI(4,5)P2 gehört zu den Phospholipiden und ist essentiell für die Fusion von SV und deren Rückgewinnung. Im Gegensatz dazu sind die Level von PI(4)P, einem weiteren Phosphoinositid, das auf der Plasmamembran lokalisiert ist, unverändert. Die erhöhten Level von PI(4,5)P2 lassen sich vermutlich durch eine direkte Assoziation von Syt1 mit der Phosphatidylinositol 4-phosphat 5-kinase Typ I (PIPK1γ) erklären, die hauptsächlich für die Synthese von PI(4,5)P2 verantwortlich ist. Zudem bestätigt hoch-auflösende Mikroskopie eine veränderte Lokalisierung von PIPK1γ an die Plasmamembran von Neuronen, welche Stn2 defizient sind und somit an der Oberfläche angereichertes Syt1 aufweisen. Zusammenfassend zeigen meine Daten, dass die Akkumulation von Syt1 an der Plasmamembran die Rekrutierung von PIPK1γ fördert und damit die lokale Synthese von PI(4,5)P2 an oder nahe der aktiven Zone ermöglicht. Somit koppelt Syt1 die PI(4,5)P2 abhängige SV Exo- und Endozytose