Hochdurchsatz-Sequenzierung humaner B-Zellrezeptor-Repertoires auf Einzelzellniveau unter Erhaltung der nativen Antikörper-Schwer- und Leichtkettenpaare

Table of Contents Declaration 3 Acknowledgements 4 Abstract 6 Zusammenfassung 8 List of Figures 14 List of Tables 15 Chapter 1: Introduction 16 1.1 Innate and adaptive immunity 16 1.2 Antibody discovery, structure and composition 17 1.3 Immunoglobulin V(D)J recombination 21 1.4 Traditional methods for investigating antibody repertoire diversity 24 1.6 Immune repertoire studies using next generation sequencing technologies 26 1.7 Limitations and recent developments in immune repertoire sequencing studies using NGS 28 1.7.1 Addressing the PCR biases using experimental approaches 29 1.7.2 Addressing the sequencing errors using computational approaches 29 1.7.3 Loss of endogenous heavy and light chain pairing information 31 1.7.4 Emulsion-based paired antibody repertoire sequencing 31 Chapter 2: Aims 33 Chapter 3: Materials and Methods 34 3.1 Cell culture, vaccination, B cell isolation and microsome preparation 36 3.1.1 ARH-77 cell culture 36 3.1.2 Vaccination and collection of human peripheral whole blood samples 37 3.1.3 CD19+ B cell isolation from human peripheral whole blood samples 37 3.1.4 Cycloheximide treatment of freshly isolated CD19+ B cells and ARH-77 cells 37 3.1.5 Buffer compositions for preparation of rER microsomes 38 3.1.6 Microsome preparation for enrichment of rough endoplasmic reticulum 40 3.2. Paired immunoglobulin heavy and light chain amplification and DNA purification methods 43 3.2.1 First protocol; overlap-extension emulsion RT-PCR assembly using leukocyte total RNA 43 3.2.2 First protocol; Overlap-extension emulsion RT-PCR assembly using freshly prepared microsomes (B cells + 10% ARH-77 cell microsomes) 45 3.2.3 Optimized protocol; overlap-extension emulsion RT-PCR assembly using leukocyte total RNA 46 3.2.4 Optimized protocol; overlap-extension emulsion RT-PCR assembly using freshly prepared microsomes (B cells + 0.5% ARH-77 cell microsomes) 47 3.2.5 Nested PCR protocols 48 3.2.6 Analytical PCR for verification of Ig HC and LC diversity 49 3.2.7 Emulsion breaking and DNA recovery 50 3.2.8 DNA recovery from agarose gel slices using Pellet Paint NF Co-Precipitant 51 3.2.9 DNA purification using Agencourt AMPure XP beads 51 3.2.10 Quantification of DNA 52 3.3 Illumina library preparation, MiSeq Sequencing and bioinformatic analysis 52 3.3.1 Library preparation for MiSeq sequencing 52 3.3.2 Illumina MiSeq 2x250 bases paired end sequencing 53 3.3.3 Bioinformatics analysis for analysis of paired Ig repertoire sequencing data 54 3.3.4 Determination of most frequent LC-CDR3 sequence paired to a given HC CDR3 sequence 55 3.4 Antibody selection, cloning, expression and binding studies for discovery of monoclonal antibodies 55 3.4.1 Selection, PCR strategy and primer design for generation of full-length paired HC-VDJ and LC- VJ sequences 55 3.4.2 Total RNA isolation and DNase treatment 57 3.4.3 First- step: RT-PCR amplification of selected HC and LC clonotypes 58 3.4.4 Second- step: PCR amplification for generation of full-length V(D)J regions for cloning 59 3.4.5 Bacterial cell culture (E. coli) 59 3.4.6 Plasmid DNA isolation from E. coli cells 60 3.4.7 Restriction digestion, ligation and transformation 60 3.4.8 Colony PCR for verification of ligation transformed clones 61 3.4.9 HEK293T cell culture 62 3.4.10 Transient transfection with polyethylenimine (PEI) 62 3.4.11 Enzyme Linked Immunosorbant Assay (ELISA) 63 3.4.12 Purification of IgG antibodies from HEK 293T cell supernatants 64 Chapter 4: Results 66 4.1 First sequencing results of paired HC-LC antibody repertoires 66 4.1.1 Simple HC-LC amplification from leukocyte RNA using emulsion overlap extension RT-PCR 66 4.1.2 Nested PCR amplification using gel purified OE RT-PCR assembly products 68 4.1.3 Analytical PCR for verification of HC and LC diversity in the assembled DNA 70 4.1.4 Paired HC-LC amplification from CD19+ B cells of a healthy individual 71 4.1.5 Bioinformatic analysis of paired antibody repertoire sequencing data obtained from MiSeq sequencing 78 4.2 MiSeq 2x250 bases paired repertoire sequencing using optimized protocol 82 4.2.1 Paired HC-LC amplification using CD19+ B cells of a healthy individual from before and 7 days after Td booster vaccination 83 4.2.2 Bioinformatics analysis of paired HC-LC sequencing data 87 4.3 Antibody Cloning, expression and binding studies 91 4.4 Brief summary of results 96 Chapter 5: Discussion 97 Bibliography 104 Appendix 120 Publications 127The adaptive immune system in vertebrates provides protection against diverse antigens and facilitates long-lasting and highly specific immunological memory. One of the most important cell types of the adaptive immune system are B cells. These express B cell receptors (BCRs; also called antibodies or immunoglobulins) on their surface which are encoded by pairs of unique heavy chains (HC) and light chains (LC), that allow binding of BCRs to a diverse array of antigens. Each B cell undergoes somatic recombination that randomly combines germline-encoded variable (V), diversity (D) and joining (J) gene segments to produce a unique BCR expressed on its surface. Random V(D)J recombination, combined with additional junctional diversity and somatic hypermutations (SHM) in activated B cells, leads to an estimated BCR diversity of >1014 in humans. Early antibody repertoire studies, employing single-cell RT-PCR and Sanger sequencing, have provided a glimpse into antibody repertoire diversity and allowed screening B cells producing desired antigen-specific monoclonal antibodies (mAbs). However, these techniques were limited by low cell numbers (>102 B cells), were laborious and involved high costs. Currently, large-scale characterization of antibody repertoires is performed by next generation DNA sequencing (NGS) platforms. Initial antibody repertoire studies using NGS have provided valuable sequencing data on one of the two antibody chains (mostly HC), missing the endogenous paired LC sequence information due to bulk lysis of B cells. The preservation of native HC-LC pairs from single B cells is very crucial for cloning and expression of antibodies and to understand the antibody repertoire diversity. Thus, retaining native antibody HC-LC pairs from single B cells, processing millions of cells in parallel, remained a major obstacle for some time. To this end, very recently several single-cell paired antibody repertoire sequencing techniques were reported. Although substantial, these methods require physical separation of single cells, and are limited by low throughput, low cell numbers (400-105 B cells), and require laborious construction of complex flow focusing or microfluidic instruments, which are expensive and require experienced personnel for operation. In contrast to the existing paired immune repertoire sequencing methods, this thesis reports the development, application and validation of a simple, cost-effective and innovative technique, employing only common laboratory equipment. In our approach, we prepared rough endoplasmic reticulum (rER) microsomes from B cells (>1 million B cells per experiment), each comprising HC and LC mRNAs from a single B cell. As a positive control for our method, we prepared microsomes from the ARH-77 cell line that expresses known HC and LC sequences. We spiked 10% (v/v) of ARH-77 microsomes to B cell-derived microsomes and passed these microsomes suspension into water-in-oil emulsion droplets containing RT-PCR master mix and multiplex primers. Within each emulsion droplet, the HC and LC mRNAs were reverse transcribed, linked, and clonally amplified by overlap-extension RT- PCR. Subsequently, a nested PCR amplification was performed on the assembled HC-LC DNA, followed by Illumina MiSeq long read sequencing. As a proof-of- concept, our first results showed that paired Ig sequences from individual B cells can be obtained and ARH-77 cell microsomes demonstrated a high HC-LC pairing accuracy of >88%. Next, we applied and validated our method by sequencing CD19+ B cells isolated from human peripheral whole blood samples, obtained before (day 0) and 7 days after Tetanus Toxoid/Diphtheria Toxoid booster vaccination (Td). Applying our method, we identified two previously and four novel TT antigen-specific mAbs. These results demonstrate the application of our technology for discovery of high-affinity mAbs. Taken together, the method presented in this thesis does not require the physical separation of single B cells and construction of complex flow focusing or microfluidic instruments. The whole process – from B cell isolation to sequencing and analyzing paired antibody repertoires – spans only four days. Antibody validation can be performed within two weeks’ time after sequencing data acquisition. In conclusion, our method provides a platform for rapid discovery of high-affinity antigen-specific mAbs with minimal costs and can applied for various aspects of immune biology.Das adaptive Immunsystem von Wirbeltieren ermöglicht den Schutz vor diversen Antigenen und beinhaltet ein langanhaltendes und hochspezifisches immunologisches Gedächtnis. Einer der wichtigsten Zelltypen des adaptiven Immunsystems sind B-Zellen. Diese exprimieren B-Zell-Rezeptoren (BCR, auch bekannt als Antikörper oder Immunoglobuline) auf ihrer Oberfläche, die durch Paare von einzigartigen schweren Ketten (HC) und leichten Ketten (LC) kodiert sind. Dies erlaubt die Bindung von BCRs zu einer Vielzahl von Antigenen. Jede B-Zelle durchläuft somatische Rekombinationen, die zufällig keimbahnkodierte variable (V), diverse (D) und verbindende (J) Gensegmente kombinieren, um einen einzigartigen BCR auf ihrer Oberfläche zu produzieren. Zufällige V(D)J-Rekombinationen in Verbindung mit resultierender CDR3-Diversität und somatischen Hypermutationen (SHM) in aktivierten B-Zellen führen im Menschen zu einer geschätzten BCR-Diversität von >1014. Erste Antiköper-Repertoire- Studien erlaubten unter Verwendung von Einzellzell-Reverser Transkriptase (RT)-PCR und Sequenzierung nach Sanger einen kleinen Einblick in Antikörper- Diversitäten und ermöglichten die Untersuchung von B-Zellen, die erwünschte antigenspezifische monoklonale Antikörper (mAbs) produzieren. Allerdings waren diese Techniken aufwendig und kostenintensiv und durch kleine Zellmengen von >102 B-Zellen limitiert. Heutzutage erfolgen umfangreiche Untersuchungen von Antikörper-Repertoires anhand von Hochdurchsatz-Sequenzierung (NGS). Frühe Studien zu Antikörper-Repertoires mittels NGS stellten wertvolle Sequenzdaten zu einer der beiden Antikörper-Ketten (meist HC) bereit. Aufgrund der unspezifischen Lyse von B-Zellen fehlte jedoch die Sequenzinformation über die endogen gepaarten LC. Der Erhalt der ursprünglichen HC-LC-Paare von einzelnen B-Zellen ist fundamental für die Klonierung und Expression von Antikörpern und zum Verständnis der Antikörper-Repertoire-Diversität. Dementsprechend war der Erhalt der nativen Antikörper-HC-LC Paare der einzelnen B-Zellen, bei paralleler Prozessierung von Millionen von Zellen, für einige Zeit ein großes Hindernis. Daher wurden verschiedene Repertoire-Sequenzierungstechniken zur Erhaltung der nativ gepaarten Antikörperketten entwickelt. Obgleich diese Methoden sehr hilfreich sind, so weisen sie doch einige Nachteile auf. Neben der physischen Separierung einzelner Zellen sind diese Techniken durch einen geringen Durchsatz von 400-105 B Zellen limitiert und benötigen eine aufwendige Konstruktion von komplexen mikrofluidischen oder durchflussfokussierenden Geräten, die kostenintensiv sind und deren Anwendung erfahrenen Personals bedarf. Diese Dissertation berichtet von der Entwicklung, Validierung und Anwendung einer innovativen, einfachen und kosteneffektiven Technik, die mit gewöhnlicher Laborausrüstung angewendet werden kann. Dabei präparierten wir Mikrosomen des rauen endoplasmatischen Retikulums (rER) von B-Zellen (>1 Million B-Zellen pro Experiment), wobei jedes Mikrosom HC- und LC-mRNAs einer einzigen B-Zelle enthält. Als Positivkontrolle verwendeten wir Mikrosomen der Zelllinie ARH-77, die bekannte HC und LC Sequenzen exprimiert. Wir fügten 10% (v/v) der ARH-77-Mikrosomen zu aus B-Zellen isolierten Mikrosomen hinzu und überführten diese Mikrosomen-Suspension in Wasser-in-Öl- Tröpfchen, die einen RT-PCR-Mastermix und einen multiplexen Primermix enthielten. Innerhalb jedes Emulsions-Tröpfchens wurden die HC- und LC-mRNAs durch Overlap-Extension-RT-PCR revers transkribiert, verbunden und klonal amplifiziert. Anschließend erfolgte mit der assemblierten HC-LC-DNA eine Nested-PCR-Amplifikation und eine darauffolgende Illumina MiSeq Long-Read- Sequenzierung. Als Nachweis der Machbarkeit dienten erste Resultate, die einerseits zeigten, dass gepaarte Ig-Sequenzen von individuellen B-Zellen ermittelt werden können und andererseits, dass bei ARH-77-Mikrosomen eine hohe HC-LC-Paarungsgenauigkeit von >88 % vorlag. Als nächstes erfolgte die Anwendung und Validierung der Methode anhand der Sequenzierung von CD19+ B-Zellen, die aus menschlichen peripheren Vollblutproben isoliert wurden. Die Blutentnahme erfolgte vor (Tag 0) und sieben Tage nach einer Tetanus Toxoid/Diphteria Toxoid Boosterimpfung (Td). Unter Anwendung unserer Methode entdeckten wir zwei bereits bekannte und vier neue TT Antigen-spezifische mAbs. Diese Ergebnisse demonstrieren die Verwendbarkeit unserer neuen Technik zur Entdeckung hochaffiner mAbs. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die in dieser Arbeit vorgestellte Methode keine physische Separierung einzelner B-Zellen fordert und keine Konstruktion elaborierter Geräte erfordert. Der gesamte Prozess – von der Isolierung von B-Zellen über die Sequenzierung zur Analyse gepaarter Antikörper-Repertoires – benötigt nur vier Tage. Im Anschluss an die Generierung der Sequenzdaten kann eine Validierung der Antikörper innerhalb von zwei Wochen erfolgen. Unsere Methode stellt eine kosteneffektive und in vielen Gebieten der Immunbiologie einsetzbare Plattform zur schnellen Entdeckung hochaffiner Antigen-spezifischer mAbs zur Verfügung