Tolérance et résistance aux antifongiques chez Candida spp. : caractérisation de nouvelles cibles thérapeutiques

The incidence of invasive candidiasis (IC) has dramatically increased over the past decades, partly due to the increasing number of at-risk patients. IC is associated with high mortality rates: however, its prognosis can be improved by early treatment. Four antifungal classes are available today for the prevention and treatment of IC: echinocandins, azoles, polyenes and pyrimidines. Due to their high efficacy and interesting safety profile, echinocandins and azoles are more commonly used. Massive use of these compounds has led to epidemiological changes in IC, with the emergence of non-albicans species which are intrinsically less susceptible to these antifungals, such as C. glabrata or C. parapsilosis. In addition, Candida spp. strains resistant, or even multiresistant, to azoles and echinocandins are increasingly isolated and associated with therapeutic failures. Antifungal activity is also limited by tolerance, a reversible phenomenon resulting from the yeast's adaptation to membrane and cell wall stresses caused by these molecules.For these reasons, identification and development of new antifungal strategies are needed. This work aimed at studying antifungal resistance and tolerance in Candida spp. and characterizing new therapeutic targets involved in these process.First, this work showed the interest of next-generation sequencing and multigene approaches to study mechanisms involved in resistance to echinocandins and azoles antifungals in Candida spp. It notably allowed to identify new mechanisms involved in antifungal resistance, which still need to be confirmed.In a second part, this work allowed to show that all the proteins of the pH-signaling pathway, known as the Rim pathway in yeasts, are involved in antifungal tolerance in C. albicans, the most frequent species responsible for IC in humans. In addition, new Rim-dependent genes were identified through RNA-sequencing, such as HSP90, coding for a major chaperone involved in the regulation of multiple cellular process, as well as IPT1, responsible for the synthesis of the main membrane sphingolipid.Both genes were previously shown to be involved in azoles and echinocandins tolerance in C. albicans, and could therefore play a role in antifungal tolerance mediated by the Rim pathway. These results offer great perspectives. Indeed, targeting the Rim pathway would allow to enhance the activity of commercially available antifungals and to indirectly target Hsp90, with no or limited toxicity as this signaling pathway is fungal-specific.Thirdly, a last part of this work performed in the context of the ANR FungiBET consortium, allowed to show that the BET protein Bdf1 in C. glabrata, which is involved in epigenetic regulation of transcription, is required for in vitro growth. More precisely, the integrity of both BD1 and BD2 Bdf1 bromodomains are essential in this species, which ranks second among causes of IC. This result confirms the first data obtained in C. albicans and the interest of inhibiting fungal BET proteins as a new antifungal strategyL'incidence des candidoses invasives a considérablement augmenté au cours des dernières décennies, parallèlement à l'augmentation du nombre de patients à risque. Ces pathologies sont associées à une morbi-mortalité élevée. Ce pronostic peut toutefois être amélioré par l'instauration d'un traitement antifongique précoce. Quatre classes de molécules antifongiques sont aujourd’hui disponibles pour la prévention et le traitement des candidoses invasives : échinocandines, antifongiques azolés, polyènes et pyrimidines. Du fait d’une efficacité importante et d’une meilleure tolérance, les échinocandines et les antifongiques azolés sont les plus largement utilisés. L'utilisation massive de ces molécules a conduit à une modification de l'épidémiologie des candidoses invasives, avec l'émergence d'espèces non-albicans intrinsèquement moins sensibles à ces antifongiques, à l'exemple de C. glabrata ou C. parapsilosis. De plus, des souches résistantes voire multi-résistantes aux échinocandines et aux antifongiques azolés sont de plus en plus fréquemment isolées, et associées à des échecs thérapeutiques. L'activité de ces antifongiques est également limitée par le phénomène de tolérance, résultant de la capacité d'adaptation des levures aux stress membranaires et pariétaux induits par ces molécules.Pour toutes ces raisons, l'identification et le développement de nouvelles stratégies antifongiques sont nécessaires. Ce travail de thèse s'inscrit dans cette optique, avec pour objectifs l'étude de la tolérance et de la résistance aux antifongiques chez Candida spp. et la caractérisation de nouvelles cibles thérapeutiques impliquées dans ces processus.La première partie de ce travail a permis de démontrer l'intérêt du séquençage nouvelle génération et d'une approche multigénique pour l'étude des mécanismes impliqués dans la résistance aux antifongiques azolés et aux échinocandines chez Candida spp. Par ce biais, il a été possible d'appréhender de nouveaux mécanismes potentiellement impliqués dans la résistance aux antifongiques, qui nécessitent toutefois d'être confirmés.Dans un deuxième temps, ce travail a permis de mettre en évidence que l'ensemble des protéines de la voie de signalisation du pH ou voie Rim chez les levures est impliqué dans la tolérance aux antifongiques chez C. albicans, l'espèce la plus fréquemment isolée en pathologie humaine. De plus, de nouveaux gènes Rim-dépendants ont été identifiés par RNA-sequencing, à l'exemple de HSP90, codant pour une protéine chaperone responsable de la régulation de multiples processus biologiques, et IPT1, responsable de la biosynthèse du principal sphingolipide membranaire. Ces deux gènes ont précédemment été impliqués dans la tolérance aux antifongiques azolés et aux échinocandines chez C. albicans et pourraient participer à la tolérance aux antifongiques médiée par la voie Rim. Ces résultats ouvrent des perspectives intéressantes : en effet, en ciblant la voie Rim, il pourrait être possible de potentialiser l'activité des molécules antifongiques actuellement commercialisées et de cibler indirectement Hsp90 tout en s'affranchissant des problèmes de toxicité car cette voie de signalisation est spécifique du règne fongique.Enfin, une dernière partie de ce travail réalisée dans le cadre du partenariat de l'ANR FungiBET a permis de montrer que la protéine BET (Bromodomain and Extra-Terminal) Bdf1 de C. glabrata, impliquée dans la régulation épigénétique de la transcription, est essentielle à la croissance in vitro. Plus précisément, l'intégrité des deux bromodomaines BD1 et BD2 de Bdf1, responsables de la liaison de cette protéine aux histones, est essentielle chez cette espèce, qui est la deuxième la plus fréquemment isolée dans les candidoses invasives en Europe et aux Etats-Unis. Ce résultat confirme les premières données obtenues chez C. albicans, et l'intérêt de l'inhibition des protéines BET fongiques comme nouvelle stratégie antifongiqu